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Sir2蛋白是一类广泛存在于原核生物和真核生物中的依赖于NAD+的去乙酰化酶,参与调节染色质沉默,DNA损伤修复,细胞凋亡,新陈代谢和细胞衰老等生命过程。虽然已鉴定出细菌Sir2类蛋白CobB能调节乙酰辅酶A合成酶(Acs)的活性,但是CobB蛋白在细菌中更多的功能仍然不清楚。另外,大肠杆菌的趋化性反应调节蛋白CheY可以发生乙酰化修饰,它有可能是CobB催化的底物,因此我们就从生化分析和遗传分析两个方面研究了CobB蛋白在大肠杆菌趋化性中的作用。
本研究通过蛋白免疫印迹杂交的方法初步证实在体外CobB可以催化CheY的去乙酰化,接着又利用质谱分析的方法进一步验证了这个结论。另外,运用表面等离子共振技术分析了乙酰化对CheY与鞭毛切换蛋白FilM之间的结合的影响,结果表明CheY的乙酰化降低了它与FliM之间的亲和力。为了进一步在细菌体内分析CobB蛋白对细菌趋化性的影响,我们利用基因敲除技术构建了六个突变株,分别是AcobB,Aacs,△(cobB)△(acs),△(cheA)△(cheZ),△(cheA)△(cheZ)△(cobB)和△(cheA)△(cheZ)△(acs)。透射电镜结果显示这六个突变株的鞭毛都是正常的,而遗传学分析则显示:(1)在几种趋化性分析实验中△cobB都表现出降低的趋化反应能力,而△acs则与野生型区别不大；(2)△cobB中的CheY体内乙酰化水平明显比野生型中的高,从而说明CobB可在细菌体内调节CheY的去乙酰化；(3)敲除cobB能够逆转△(cheA)△(CheZ)突变株的趋化反应能力。综合以上实验结果,我们认为CobB确实能通过催化CheY的去乙酰化来调节大肠杆菌的趋化性。
总之,本研究鉴定了细菌CobB蛋白的一个新功能,扩大了我们对原核生物中Sir2类蛋白的功能的认识,为进一步理清细菌趋化性的调节机制提供了新的线索。