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背景脊髓损伤严重影响着25万美国人的生活质量,恢复缓慢,因此成为全世界科学家的研究热点。已经证实,许多药物、神经营养因子、组织细胞移植及基因治疗是目前主要的脊髓损伤修复措施。其中,终生具有成髓鞘能力的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)深受广大研究人员的喜爱。脊髓损伤引起的缺血和继发性改变使局部条件恶化,加重了神经损伤。因此,改善脊髓损伤局部的血液循环,减轻继发性损伤便成为脊髓损伤的又一研究热点。已经证实,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在脊髓损伤后表达增加,可能与损伤后的功能恢复有关。目的研究一种简便、经济实用的获得新生大鼠嗅鞘细胞的方法,探讨嗅球源性嗅鞘细胞(OECs)移植和鞘内重复注射VEGF对脊髓损伤(SCI)后功能恢复的促进作用,并研究二者对神经元和神经纤维的协同保护作用。方法取1-2天的雌性新生大鼠,无菌条件下取下双侧嗅球,剥去血管和软脑膜,经胰酶消化和机械吹打分散成单细胞悬液,将差速贴壁后的大鼠嗅鞘细胞首先应用20%胎牛血清和lOug/ml阿糖胞苷培养24小时,然后采用含1%胎牛血清和25ng/ml神经生长因子(nerve growth factor, NGF)的DMEM/F12培养基进行体外培养。每天观察嗅鞘细胞的生长变化,第9天时采用形态学和免疫细胞化学染色对细胞及其纯度进行鉴定,并收集细胞,调整细胞密度为1 x107/ml备用。将75只实验动物随机分为5组,假手术对照组(CON组)、脊髓损伤组(SCI组)、血管内皮生长因子组(VEGF组)、嗅鞘细胞组(OECs组)和联合治疗组(VEGF+OECs组),在脊髓损伤后不同时段进行肢体活动BBB评分,术后8w苯巴比妥麻醉后灌注处死大鼠,取T7-L1脊髓节段,通过HE染色检测脊髓损伤区神经纤维和神经元病理改变；通过免疫组织化学检测各组大鼠脊髓caspase-3(1:150)和vWF(1：200)表达。每组3只动物利用透射电镜观察超微结构的变化。应用SPSS 16.0统计软件进行处理分析,数据以x±s表示,BBB评分采用重复测量数据的方差分析,判断行为恢复情况。其他数据的组间比较采用t检验,以P<O.05为差异有显著性意义。结果体外培养的大鼠嗅鞘细胞神经生长因子受体p75 (nerve growth factor receptor p75, NGFRp75)染色呈阳性反应,细胞呈双极和三级,突出细长,并渐结成网状,在体外培养的第7天纯度为95%,9天时为90%,且形态良好。术前所有大鼠和术后对照组后肢行为评分为21分,术后脊髓损伤动物均出现后肢运动功能的自行恢复,尤其在手术后的前4周。在4周后,VEGF组和OECs组优于SCI组,联合治疗组的行为恢复更为明显。HE染色和超微结构观察可见,CON组损伤处残留少量组织,神经纤维和神经元损害严重,大量有髓纤维严重受损,中央轴突消失；VEGF组损伤处均见组织增生,神经纤维和神经元受损较CON组轻,OECs组细胞中有大量空泡化的线粒体,OECs+VEGF组神经纤维和神经元损伤最轻,腹侧有神经纤维通过,大量薄髓鞘纤维中可见微丝、微管和受损较轻线粒体。免疫组化显示,CON组、SCI组、VEGF组、OECs组和VEGF+OECs组Caspase-3阳性细胞数分别为(8.33±5.43)、(25.89±10.75)、(14.62±5.60)、(23.47±8.33)、(13.38±6.33)/HPF,SCI组、VEGF组、OECs组和VEGF+OECs组均显著高于CON组,差异有统计学意义(P<0.05)；SCI组、OECs组显著高于VEGF组、VEGF+OECs组,差异有统计学意义(P<0.01)；CON组、SCI组、VEGF组、OECs组和VEGF+OECs组脊髓中vWF阳性血管数分别(13.87±2.59)、(11.25±3.19)、(14.42±4.05)、(11.94±3.77)、(16.50±6.25) /HPF。VEGF组、VEGF+OECs组vWF阳性血管数显著多于SCI组、OECs组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1、阿糖胞苷结合NGF是一种简单实用的嗅鞘细胞纯化培养方法。2、VEGF对大鼠脊髓损伤修复有一定的促进作用,并可恢复损伤神经的部分功能,对受损神经纤维和神经元有保护作用。3、嗅鞘细胞移植可部分恢复脊髓损伤大鼠的部分神经功能,对受损神经纤维和神经元有保护作用。4、嗅鞘细胞(OECs)移植联合鞘内重复注射VEGF对大鼠脊髓损伤修复有明显的促进作用,并可恢复损伤神经的部分功能,对受损神经纤维和神经元有保护作用,二者有协同作用。意义本研究采用阿糖胞苷结合NGF体外培养纯化大鼠嗅球源性嗅鞘细胞,重力打击制作脊髓挫伤模型,将嗅鞘细胞移植到脊髓损伤部位,联合重复鞘内注射VEGF,探讨OECs和VEGF对脊髓损伤的功能恢复的促进作用,并研究二者对神经元和神经纤维的协同保护作用。