黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根,是临床最为常用的清热药。2015年版《中华人民共和国药典》收录黄芩片和酒黄芩两种炮制品。黄芩生用苦寒,清热泻火解毒力强,酒炙缓和其苦寒之性,引药上行,用于上焦肺热及四肢肌表之湿热。酒炙可致黄芩药性发生一定的变化,明确炮制对中药药性的影响,是保证临床疗效的前提,而阐明炮制致中药药性变化的科学内涵是中医用药是否具有科学性的根本所在,也是促进中药饮片从经验型走向科学化和现代化的关键。查阅历版药典及各省市炮制规范发现黄芩片、酒黄芩的炮制工艺多为经验性描述,缺乏具体参数,同时对两种饮片的外观性状描述有所不同。黄芩主要药效成分是黄芩苷等黄酮类成分,黄芩酒炙过程可能对黄芩物质基础产生一定的影响。中药所含有效成分是其药效的物质基础,是影响体内代谢的重要因素,物质基础的变化也会引起生、制黄芩饮片在体内代谢的差异,最终导致药性和药效的变化。本文采用现代分析仪器与多元统计方法相结合,针对酒炙致黄芩药性改变的科学内涵展开研究,以期为黄芩生、制饮片的临床合理用药提供参考。研究目的优选黄芩切制、酒炙工艺参数,探讨炮制过程对黄芩饮片质量的影响。明确酒炙对黄芩饮片的颜色、滋味、物质基础、体内代谢的影响,分析各指标与药性的相关性,阐释酒炙致黄芩药性变化的科学内涵,为临床用药的安全与有效提供依据。研究方法1.以外观性状、成分含量、醇溶性浸出物为评价指标,采用单因素考察结合综合评分法优选黄芩切制工艺;以黄酒量、闷润时间、炒炙温度、炒炙时间四个因素进行正交试验设计,采用综合评分法优选黄芩酒炙工艺。2.采用色差仪、电子舌技术量化检测黄芩酒炙前后的颜色、滋味,采用PCA、OPLS-DA等多元统计方法分析黄芩酒炙前后的颜色和滋味差异。3.利用HPLC建立黄芩片、酒黄芩的特征图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对特征图谱进行处理,进一步评价黄芩片、酒黄芩的整体质量,分析黄芩酒炙前后的质量差异。利用UPLC-QTOF-MS、UPLC-TQMS定性及多成分定量比较生、制饮片的化学成分,结合多元统计方法分析酒炙前后的化学成分差异。利用HS-SPME-GC-TQMS 比较生、制饮片的挥发性成分。4.以正常小鼠为对象,分别给予蒸馏水、黄芩片提取物和酒黄芩提取物,采用1H-NMR代谢组学技术结合多元统计方法比较两种饮片对小鼠宏观体征及血清、肝脏代谢的影响,进一步找出血清、肝脏的差异代谢物。分析差异代谢物的代谢通路及代谢途径。5.采用简单相关分析、典型相关分析、PLS相关模型对黄芩饮片的颜色、滋味、成分、代谢物的潜在差异因素进行相关性分析,从整体角度阐释酒炙致黄芩药性改变的科学内涵。研究结果1.利用单因素考察、综合评分法对水煮、常压蒸、加压蒸三种软化方法进行比较,确定的黄芩切制工艺为:取净黄芩,常压蒸30分钟,取出,切1.5 mm薄片,60℃鼓风干燥3小时,取出,晾凉,即得。利用正交试验、综合评分法确定黄芩酒炙工艺为:取黄芩片,加1 0%黄芩片质量的黄酒拌匀,闷润15分钟,置炒制容器内,140±10℃炒炙5分钟,取出,晾凉,即得。验证试验表明切制、酒炙工艺重复性好,饮片质量稳定。2.黄芩片颜色为外表皮黄棕色或棕褐色,切面黄棕色或黄绿色;酒黄芩颜色略深,略带焦斑。色差仪检测结果表明,黄芩酒炙后饮片L*值降低,a*值、b*值升高,但E*值基本无变化。PCA、OPLS-DA结果表明黄芩酒炙前后颜色存在差异,红色、黄色是生、制饮片差异颜色。电子舌检测结果表明酒黄芩比黄芩片的苦味降低,咸味增加,进一步分析可知咸味和苦味是影响黄芩和酒黄芩整体味道的差异滋味。3.建立了黄芩片、酒黄芩的特征图谱,同时对5种黄酮类成分进行定量检测,标定14个共有峰,10批黄芩片、酒黄芩的相似度范围分别在0.875～1、0.986～1之间,表明酒炙后黄芩饮片整体质量更加稳定。利用UPLC-QTOF-MS法对黄芩片、酒黄芩进行了定性分析,二者成分基本一样,发现50种成分,鉴定出44种成分,主要为黄酮类成分,结果表明黄芩酒炙前后并没有引起黄酮类成分的增加或消失。利用UPLC-TQMS定量比较黄芩酒炙前后11种黄酮类成分的含量,结果表明黄芩苷、汉黄芩苷等黄酮苷类成分含量略有下降,黄芩素、汉黄芩素等黄酮苷元类成分含量稍有增高。以成分含量为变量进行PCA分析,结果表明2种饮片在成分含量上具有差异性,黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸苷的含量是引起黄芩酒炙前后成分差异的主要因素。利用HS-SPME-GC-TQMS 比较两种饮片挥发性成分,黄芩片中共鉴定出33个化学成分,酒黄芩片中共鉴定出32个化学成分,其中共有成分有17个,相对定量结果表明黄芩酒炙后主要色谱峰的强度有所降低,这可能与加热炮制对挥发性成分的破坏有关。黄芩酒炙前后挥发性成分的种类及含量上均有一定的差异,这说明加辅料黄酒和加热炮制对黄芩挥发性成分有一定的影响。4.随着给药时间延长,小鼠体质量增长速度变慢,黄芩片组较酒黄芩组体质量增长速度更慢,同时两种饮片均可降低小鼠肛温,黄芩片组较酒黄芩组肛温降低更多。利用1H-NMR技术对各组小鼠血清和肝脏中的代谢物进行代谢分析,黄芩片组和酒黄芩组的血清和肝脏代谢物基本一样,其中在血清核磁图谱中指认了 32种化合物,肝脏核磁图谱中指认出了 44种化合物。进一步分析血清和肝脏中的差异代谢物,相比于空白组,各给药组从血清和肝脏中分别筛选出11、19个差异代谢物。代谢通路结果表明,黄芩片、酒黄芩对正常小鼠机体的影响主要与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢,能量代谢,苯丙氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,酪氨酸代谢,柠檬酸循环(三羟酸循环),丙酮酸代谢,精氨酸生物合成9条通路有关,表明黄芩片、酒黄芩可通过对氨基酸代谢、糖类代谢、脂类代谢、酮体的分解与合成影响小鼠的机体代谢。其中酒黄芩组小鼠的葡萄糖和胆碱含量高于黄芩片组,表明黄芩经黄酒炮制后可增强小鼠能量代谢能力,增加了能量的消耗,进而体现酒炙后黄芩的寒性减弱,可能为酒炙致黄芩药性改变的途径和机理。5.简单相关分析结果发现,a*值(红色)与黄芩苷具有显著负相关关系,与黄芩素具有显著正相关关系;b*值(黄色)呈相反规律。CTS传感器(咸味)与黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸苷没有相关关系,SCS传感器(苦味)与黄芩苷具有显著正相关关系。经典相关分析结果发现,血清中黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸苷与脂质、3-羟基丁酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、胆碱、甘油磷酸胆碱、鲨肌醇呈正相关,与α-葡萄糖、β-葡萄糖呈负相关,黄芩素则呈相反规律。肝脏中黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸苷与亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、胆碱、肝糖原、富马酸、酪氨酸、苯丙氨酸、腺苷呈正相关,与乳酸、乙酸、谷胱甘肽、琥珀酸、甘油磷酸胆碱、甜菜碱、牛磺酸、黄嘌呤呈负相关,黄芩素同样呈相反规律。研究结论辅料黄酒的引入以及加热炮制的条件引起黄芩饮片外观性状和物质基础的改变,物质基础的变化引起小鼠体内代谢通路的改变,最终导致黄芩酒炙前后药性发生改变。本文确定了黄芩切制、酒炙工艺,定性定量分析了黄芩饮片的化学成分,初步阐明了酒炙致黄芩药性改变的科学内涵,可为解决“炮制所致中药药性变化科学内涵的揭示”的难题提供数据支持。