论文部分内容阅读
研究目的近年来,通过细胞工程技术体外分离和培养所需的靶细胞,已成为神经退行性疾病细胞替代治疗的研究热点。其中骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchvmal stem cells, BMSCs)由于来源丰富、取材简便,易于体外分离、培养、纯化,具有多向分化潜能等优点,已成为一种良好的替代治疗的靶细胞,在神经再生领域有着广泛的应用价值。心脉隆注射液是由美洲大蠊干品经过浸渍、减压浓缩、分离得到心脉隆浸膏再溶解后制得的,主要有扩血管、利尿、改善微循环、纠正神经内分泌失衡等作用。本研究以大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,心脉隆注射液为诱导剂,探讨心脉隆注射液体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化的可行性。研究方法1.贴壁筛选法培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),倒置显微镜下逐日观察原代、传代细胞的生长情况及形态特征。2.流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD90、CD34、CD45。3.以心脉隆注射液为诱导剂,定向诱导第3代大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞转化,每隔1h倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。4.免疫细胞荧光法鉴定诱导4h、12h、36h后巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)、微管相关蛋白2(Microtubule associated protein-2, MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表达情况。5. RT-PCR生检测诱导36h后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)mRNA的表达。结果1.原代接种的细胞散在分布,折光性强,混杂其他细胞,1d后可见少量单核圆形细胞贴壁生长,3d后细胞大部分贴壁,有聚集生长倾向；8-10d后细胞呈集簇状生长,每个集簇细胞中心呈放射状或螺旋状,细胞铺满皿底并融合。传代后细胞增殖速度加快,3-5代后已纯化为全梭形细胞,呈鱼群样排列,6代后细胞生长减慢,部分开始变得宽大扁平。2.流式细胞学检测示CD29、CD90高表达(阳性细胞百分比分别为99.06%、99.61%),CD34、CD45低表达(阳性细胞百分比分别为2.03%、2.00%)。3.诱导2h后实验组细胞形态即开始改变,部分长梭形细胞的胞体变小,变为不规则形或圆形。随着诱导时间延长,突起不断增长,呈双极、多极形,36h诱导达到高峰,细胞形态明显变化,每个细胞有两个或多个突起并形成网状结构,呈典型神经元样细胞。对照组细胞形态无明显变化。4.诱导4h、12h后,实验组Nestin阳性表达率分别为(81.0±1.6)%、(22.5±1.9)%,36h后,Nestin|阴性。诱导4h后,实验组NSE、MAP2阴性,12h、36h后,NSE阳性表达率分别为(73.5±2.2)%、(94.3±1.8)%,MAP2阳性表达率分别为(80.0±2.2)%、(96.4±2.8)%。诱导4h、12h、36h后实验组GFAP阴性,对照组Nestin、NSE、MAP2、GFAP均为阴性。5.RT-PCR结果显示,诱导36h后,实验组细胞表达NSE mRNA,不表达GFAP mRNA。对照组细胞NSE、GFAP mRNA均不表达。结论1.贴壁筛选法是一种简单、快速分离及纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法。2.心脉隆注射液可在体外快速、高效地诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。3.心脉隆注射液在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞前,经历了短暂的神经前体细胞阶段。