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1 研究背景和目的随着当今生活节奏的逐步加快,收入差距的渐渐扩大以及COVID-19的大流行,全球范围内人们的焦虑和压力也逐步增加。精神压力会导致众所周知的适应性生理变化,包括血压、心率、内分泌以及神经活动等异常,严重扰乱了人体的健康以及日常社交。近年来,越来越多的证据表明精神压力与肿瘤的发生发展密切相关。在经历肿瘤诊断、手术、化疗和遭受多种肿瘤相关并发症之后,绝大多数肿瘤患者都会遭受严重精神压力,这不仅影响肿瘤患者治疗的积极性,还会促进肿瘤的进展。精神压力能够影响多种肿瘤表型,包括增殖、转移、基因组的不稳定性以及血管生成等。最近的临床前实验证明,精神压力增加肿瘤细胞的自噬,从而增强胃癌的增殖和转移。精神压力会导致各种代谢紊乱并抑制患者的免疫系统,引起抗肿瘤治疗的失败。此外,精神压力引起的肠道微生物群的变化,也与生理系统疾病以及肿瘤的恶化密切相关。因此,精神压力作为影响肿瘤进展的重要因素之一,深入探究其具体作用机制十分必要,为制定缓解精神压力对肿瘤促进作用的干预策略提供重要理论基础。肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一,也是导致癌症相关死亡的主要原因,据估计,每年约有220万肺癌新发病例,100多万肺癌患者死亡。而非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）作为肺癌的一个亚型,约占所有肺癌的85%,并且70%左右的患者发现时已处于中晚期,5年生存率仍较低。过去的二十年,随着对肿瘤生物学的深入了解,新药研发的加速以及肺癌早诊的推广,肺癌患者的生存率得到显著提高。特别是近年来,靶向治疗（Targeted therapy）和免疫治疗（Immunotherapy）的临床应用,极大增强了肺癌的治疗效果,同时由于治疗特异性强,副作用少,患者的生活质量也得到了较大改善。但是大多数的NSCLC对目前的治疗都会产生耐药性,并发生进展,因此更多影响肿瘤发生发展的机制需要被挖掘。目前,对NSCLC患者的干预主要集中在肿瘤细胞本身,而NSCLC确诊和治疗过程所导致的患者的精神压力却往往被忽视。越来越多的研究都表明,精神压力是促进NSCLC进展的重要危险因素之一,阐明这一现象的机制,将为NSCLC精准治疗提供新的思路。本文利用国际标准通用的精神压力量表对NSCLC患者进行精神压力评估,分析了精神压力与患者临床参数以及免疫功能的关系。通过应用16SrDNA测序技术,质谱检测技术,转录组测序技术检测分析,发现精神压力能够引起NSCLC患者肠道菌群组成改变,导致肠道上皮细胞5-羟色胺转运蛋白（Serotonin Transporter,SERT）,以及单胺氧化酶A（monoamine oxidase A,MAOA）表达升高,致使色氨酸代谢途径紊乱,作为该代谢途径终端产物的5-羟吲哚乙酸（5-Hydroxyindole-3-acetic acid,5-HIAA）增多。同时,5-HIAA能够与CD8+T细胞内的芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor,AhR）结合,促进CD8+T细胞PD-1蛋白的表达,抑制NSCLC患者体内的抗肿瘤免疫。同时,动物实验中,当去除肠道菌群后,精神压力对肿瘤的促进作用会减弱,提示对于精神压力NSCLC患者,制定针对肠道菌群的治疗策略,可能有利于抑制肿瘤的进展。同时精神压力与非小细胞肺癌PD-1抑制剂治疗效果呈负相关,通过对多种神经递质的定量分析,发现去甲肾上腺素起到关键作用,进一步的体内外实验结果证明精神压力促使去甲肾上腺素的产生增多,而去甲肾上腺素能够激活非小细胞肺癌细胞Wnt7A/β-catenin信号通路,抑制肿瘤组织CXCL9的产生,引起CD8+T细胞在肿瘤组织中的浸润减少,从而产生对PD-1抑制剂的抵抗。2 实验方法2.1 第一部分 精神压力对非小细胞肺癌患者临床参数及预后的影响2.1.1 基于国际通用的精神压力测量表对200例NSCLC患者进行精神压力评估,采集其临床数据,预后随访;2.1.2 对收集的患者量表整合分析,研究精神压力测定的各项指标与NSCLC患者的TNM分期（Tumor,Node,Metastasis）、临床分期（Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ）、EGFR和ALK突变状态及PD-1表达等临床指标的相关性,根据精神压力量表评分将NSCLC患者分为精神压力高低两组,分析不同组肿瘤分期组成并绘制生存曲线;2.1.3 采用多元线性回归（multivariable linearregression model）的数据分析方法探究精神压力影响NSCLC进展的中介因素;2.1.4 利用转录组学探究精神压力对肿瘤患者免疫信号通路的影响;2.1.5 利用流式细胞仪比较不同精神压力NSCLC患者外周血CD8+T细胞功能;2.1.6 利用束缚法建立小鼠精神压力荷瘤模型,收集小鼠的外周血、结肠、粪便备用,验证精神压力对NSCLC进展的影响,并检测小鼠脾脏及肿瘤组织中CD8+T细胞功能。2.2 第二部 分精神压力介导肠道菌群对非小细胞肺癌肿瘤免疫的调节将患者根据精神压力量表评分分为高压力组和低压力组,并基于小鼠压力模型的建立,将小鼠分为正常组和压力组,将收集到的患者和小鼠外周血及粪便进行多组学分析研究:2.2.1 采用16SrDNA序列测序技术检测不同压力组小鼠粪便中肠道菌群组成差异;2.2.2 利用质谱检测技术探究不同压力患者血清和小鼠血清及粪便中代谢产物的差异;2.2.3 基于差异代谢产物进行代谢通路富集分析,探究主要代谢途径的改变。2.2.4 探究代谢途径紊乱对NSCLC患者分期预后以及免疫功能的影响;2.2.5 体外实验研究代谢途径紊乱影响免疫功能的机制及对应基因对NSCLC患者临床参数及预后的影响;2.2.6 动物实验验证:建立小鼠精神压力模型及小鼠肠道菌群去除模型,并皮下接种LLC细胞,验证上述差异基因、信号通路的改变及其机制。2.3 第三部分 精神压力介导神经递质影响非小细胞肺癌免疫治疗的机制2.3.1 分析精神压力与PD-1抑制剂治疗NSCLC患者效果的相关性;2.3.2 利用ELISA检测PD-1抑制剂治疗敏感和抵抗患者主要神经递质的变化;2.3.3 动物实验探究差异神经递质对肿瘤免疫微环境的影响;2.3.4 体内外实验以及转录组侧学探究差异神经递质影响免疫微环境的可能机制;2.3.5 利用基因编辑技术验证差异神经递质影响免疫微环境的分子生物学机制。3研究结果3.1 第一部分 精神压力对非小细胞肺癌患者临床参数及预后的影响3.1.1 精神压力与非小细胞肺癌患者的临床分期及TNM分期呈正相关,而与患者的预后呈负相关。3.1.2 精神压力能够促进CD8+T细胞PD-1的表达,抑制Granzyme B的产生,从而使抗肿瘤免疫受到抑制,促进肿瘤的进展。3.2第二部分 精神压力介导肠道菌群对非小细胞肺癌肿瘤免疫的调节3.2.1 精神压力能够引起非小细胞肺癌患者肠道菌群组成的改变。3.2.2 肠道微环境的变化能够促进色氨酸代谢途径的紊乱。3.2.3 色氨酸代谢紊乱,导致5-HIAA的生成增多,能够抑制CD8+T细胞的功能,与患者的预后呈负相关。3.2.4 5-HIAA能够与CD8+T细胞AhR蛋白结合,促进PD-1的表达,而敲除AhR基因可以抑制5-HIAA对T细胞PD-1表达的促进作用。3.2.5 去除肠道菌群能够抑制精神压力引起的肿瘤进展。3.2.6 去除肠道菌群能够抑制精神压力引起的色氨酸紊乱,从而逆转抗肿瘤免疫的抑制。3.3 第三部分 精神压力介导神经递质影响非小细胞肺癌免疫治疗的机制3.3.1 精神压力患者产生的去甲肾上腺素导致患者对PD-1抑制剂治疗产生抵抗,而普萘洛尔的应用可以逆转去甲肾上腺素的作用。3.3.2 去甲肾上腺素能够抑制CD8+T细胞在肿瘤组织的浸润。3.3.3 去甲肾上腺素能够激活肿瘤细胞Wnt7A/β-catenin通路,抑制CXCL9的表达。4结论4.1 精神压力与患者的分期,预后以及PD-1的表达存在显著相关性,精神压力是NSCLC进展的重要危险因素。4.2 精神压力能够改变肠道菌群的组成,并引起色氨酸代谢途径的紊乱,导致色氨酸代谢终产物5-HIAA生成增多,5-HIAA能够诱导CD8+T细胞PD-1的表达,抑制抗肿瘤免疫,促进肿瘤的进展。4.3 针对肠道菌群的治疗策略,可以抑制精神压力对NSCLC进展的促进作用。4.4 精神压力产生的去甲肾上腺素能够激活非小细胞肺癌细胞Wnt7A/β-catenine信号通路,抑制肿瘤组织CXCL9的产生,引起CD8+T细胞在肿瘤组织中的浸润减少,从而产生对PD-1抑制剂的抵抗,而普萘洛尔的应用可以逆转去甲肾上腺素的作用。综上所述,我们从新的维度阐明非小细胞肺癌发生发展的分子机制,为后期开发新的抗癌疗法奠定理论基础。