前言白癜风（Vitiligo）是一种常见的色素脱失性疾病,是功能性黑色素细胞被破坏导致的皮肤局部或广泛的白斑,在世界范围内发病率较高。本病好发于青少年,肤色深的人种易患病,春夏季高发,皮损部位以曝光和摩擦部位多见。虽不致命,但是严重影响患者的社交甚至出现心理问题。目前尚无特效的治疗方法,外用糖皮质激素、钙调神经磷酸酶抑制剂,紫外线光疗,系统应用糖皮质激素及手术等联合治疗,部分患者可起到一定作用。但是疗程长,因此研究高效、有多方面保护作用的芍药苷（Paeoniflorin,PF）是否可用于治疗白癜风,前景值得期待。人类黑素细胞（Melanocyte,MC）起源于外胚层的神经嵴,之后迁移并定植在表皮基底细胞层和毛囊。细胞因子介质、激素的刺激使MC产生和分泌细胞因子、细胞外基质成分,与周围的细胞及组织交互影响。白癜风目前病因及发病机制尚不完全明确,主要包括遗传、氧化-抗氧化失衡、神经体液调节紊乱、自身免疫等学说。现有研究表明自身免疫在白癜风发病中起重要作用,白癜风患者体内存在免疫细胞异常活化、黑素细胞相关抗体产生。白癜风患者血清中查到大量的黑素细胞相关抗体,通过补体介导的抗体依赖细胞毒作用而破坏黑素细胞。白癜风患者的皮损出现淋巴细胞上移至表皮的现象,且黑素细胞被破坏程度与淋巴细胞的浸润呈现正相关,提示两者之间可能存在必然的联系。Van den Boom等人研究表明白癜风皮损周围黑素细胞特异性的CD8⁺T细胞可浸润到移植的正常的皮肤,杀死黑色素细胞,这表明CD8⁺T细胞参与白癜风疾病进展。白癜风白斑皮损处浸润的淋巴细胞,主要为CD8⁺T细胞,进展期皮损边缘明显的T淋巴细胞浸润,并且具有显著的I型细胞因子分泌特征,如肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素γ（IFN-γ）增,并可进一步上调细胞间黏附分子1（Intercellular cell adhesion molecule1,ICAM-1）的表达,诱导更多的T淋巴细胞迁移、浸润,为细胞免疫损伤机制提供了依据。CD8⁺T细胞如何迁移到皮损处是研究的热点。趋化因子是能够吸引白细胞迁移的低分子蛋白,在介导细胞毒性免疫和炎症反应中发挥关键性的作用。已经发现几种趋化因子与CD8⁺T细胞迁移相关。项蕾红等通过临床样本研究证实,白癜风患者血清中CXCL（chemokine C-X-C motif ligand）10升高,进展期白癜风患者治疗后血清CXCL10降低。最新研究表明,白癜风患者皮损处趋化因子CXCL10表达升高,表达相应受体CXCR（chemokine C-X-C motif receptor）3的CD8⁺T细胞浸润,并用小鼠模型证实CXCL10诱导黑素细胞特异的CD8⁺T细胞向皮损处迁移;且小鼠白癜风模型中使用CXCL10中和抗体可阻止色素脱失、促进白斑复色。免疫微环境（TNF-α、IFN-γ）显著促进人正常黑素细胞PIG1的CXCL10表达和分泌。转基因鼠模型揭露CD8⁺T细胞聚集依靠CXCR3、CCR（chemokine C-C motif receptor）5、CCR4。Harris JE等发现趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11都是CXCR3的配体,在白癜风皮损中升高显著。白癜风鼠模型的功能研究证实IFN-γ-CXCL10-CXCR3轴是色素减退进展及维持的关键因素,敲除CXCR3可以预防白癜风并促进白癜风白斑复色。李春英等实验得出氧化应激（H₂O₂诱导）通过激活角质形成细胞（Hacat）上调CXCL16表达,诱导CD8⁺T细胞发生迁移。芍药苷（Paeoniflorin,PF）来源于芍药、牡丹的根,是白芍总苷（Total glucosides of paeonia,TGP）的主要有效成分,有多种药理活性,如止痛及神经保护、抗氧化、抗炎、免疫调节和抗肿瘤等。PF占TGP的90%以上,TGP广泛用于治疗各种炎症性和自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、变应性接触性皮炎、银屑病、急性肾损伤、肝炎等,疗效满意。叶荣等用白芍总苷联合外用吡美莫司治疗散发型白癜风,可促进白斑恢复,改善外周血CD4⁺/CD8⁺T细胞。因此,本研究探索PF是否影响黑素细胞炎症因子、趋化因子表达,可能的通路研究,这将为PF治疗白癜风提供理论依据。材料与方法1.实验对象PIG3V细胞是来源于白癜风患者白斑周围正常皮肤的黑素细胞系,来自美国Loyola大学,本科室冻存,用含10%胎牛血清及100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、1%黑素细胞生长添加因子（HMGS-2）的254培养液培养,放置于含5%CO₂、37℃的孵箱中孵育。2.芍药苷配制25μg PF原料粉末（分子量:480.46）溶于250μl二甲基亚砜（DMSO）,得到200μM工作液,分装后放至-80℃冰箱中避光保存。3.MTS法检测芍药苷对细胞增殖的影响利用MTS法检测PF对细胞增殖的影响。PIG3V细胞以1500个/孔接种于96孔板,培养24h后,分别加入不同浓度的芍药苷（0,50,100,200,400,600μM）。分别培养24h、48h、72h,用酶标仪检测490nm处吸光度值。4.流式细胞术检测不同浓度芍药苷对细胞凋亡及周期的影响利用流式细胞术检测不同浓度芍药苷对细胞凋亡及周期的影响。将PIG3V细胞接种于6孔板,加入不同浓度芍药苷预处理12h、24h,之后加入H₂O₂诱导12h,收集细胞,用FITC Annexin V凋亡试剂盒、PI检测细胞凋亡及周期。5.实时荧光定量PCR检测细胞炎症因子的表达利用实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR）检测炎症因子表达。将PIG3V细胞接种于6孔板,加入芍药苷预处理12h、24h,H₂O₂诱导1h、4h、8h、12h,利用qRT-PCR法检测细胞IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1、IFN-γmRNA的表达变化。严格按照总RNA提取说明书（Qiagen）提取总RNA,逆转录试剂盒（Promega）逆转录合成cDNA,利用Go Taq qPCR Master Mix试剂盒（Promega）进行扩增,利用CT值计算2-ΔΔCt,进行基因表达量分析。6.ELISA法检测细胞上清IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1、IFN-γ的表达利用ELISA法检测加入H₂O₂及芍药苷后细胞上清IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1、IFN-γ的表达水平的变化。将细胞接种于6孔板,加入芍药苷预处理24h,H₂O₂诱导4h、8h、12h、24h,收集细胞上清,加样、洗板、孵育抗体、洗板、显色后用酶标仪检测450nm,540nm处吸光度值。7.PCR array法检测治疗组（PF 400μM+H₂O₂）与对照组（H₂O₂）趋化因子mRNA差异表达PCR array法检测。将细胞接种于6孔板,加入芍药苷培养24h,H₂O₂诱导8h,收集细胞,采用PCR array对PIG3V细胞治疗组（PF400μM+H₂O₂）与对照组（H₂O₂）进行趋化因子mRNA表达的检测,计算差异表达的趋化因子。之后用实时荧光定量PCR及Western blot对差异表达下调的趋化因子进行验证。8.Western blot检测NF-κB通路蛋白的表达采用Western blot法检测细胞NF-κB p-p65、NF-κB p-65的表达。将细胞接种于6孔板,加入芍药苷预处理24h,H₂O₂诱导8h、12h、24h,裂解细胞,严格按步骤提取细胞内总蛋白,BCA测取蛋白浓度,制备胶、跑电泳、转膜、封闭、孵育抗体（NF-κB p-p65、NF-κB p-65、GAPDH）、ECL显色拍照及灰度分析。9.激动或抑制NF-κB,Western blot检测差异表达的趋化因子GPR17蛋白表达的变化、流式细胞术检测对细胞凋亡的影响将细胞接种于6孔板,加入芍药苷预处理24h,NF-κB激动剂脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）或抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸酯（pynolidine dithiocar-bamate,PDTC）联合H₂O₂诱导黑素细胞12h、24h,提取细胞蛋白,利用Western blot检测差异表达下调的趋化因子GPR17蛋白表达的变化,流式细胞术检测细胞凋亡的变化。10.白癜风患者谷胱甘肽过氧化物酶水平的Meta分析检索数据库:PubMed,Cochrane Library,Web of Science,中国知网（CNKI）和万方医学数据库。检索年限最早时间到2015年12月。纳入符合标准的研究,进行数据分析。11.统计学分析应用GraphPad Priam 6.0软件对数据进行分析及图表绘制,每组样本采用均值±标准误（Mean±SEM）来表示,两组比较采用非配对t test。应用Stata 11.0软件对纳入的研究进行白癜风患者谷胱甘肽过氧化物酶水平Meta分析。P<0.05时认为差异有统计学意义。结果1.芍药苷对PIG3V细胞增殖活性的影响加入不同浓度芍药苷（0,50,100,200,400,600μM）,培养24h、48h、72h,芍药苷浓度≤200μM时,细胞增殖活性未见明显改变（P>0.05）。芍药苷浓度≥400μM时,细胞增殖活性明显增强（P<0.01）。2.H₂O₂对PIG3V细胞凋亡的影响不同浓度H₂O₂对细胞凋亡的影响,通过流式细胞术验证。加入不同浓度H₂O₂（0,0.75,1mM）,诱导12h,PIG3V细胞凋亡明显增加（P<0.01）,细胞凋亡比率分别为6.45%、22.00%、56.80%,且具有浓度依赖性。因此,本研究后续实验对于PIG3V细胞,H₂O₂诱导的浓度选择为0.75mM,诱导时间为12h。3.不同浓度芍药苷对H₂O₂诱导的PIG3V细胞凋亡、周期的影响（1）不同浓度芍药苷对H₂O₂诱导的细胞凋亡的影响,通过流式细胞术验证。不同浓度PF（50,100,200,400μM）预处理12h,H₂O₂诱导12h,芍药苷组（400μM）较H₂O₂组细胞凋亡率减少（P<0.05）,而芍药苷组（50,100,200μM）较H₂O₂组细胞凋亡率无明显变化（P>0.05）。不同浓度PF（50,100,200,400μM）预处理24h,H₂O₂诱导12h,芍药苷组较H₂O₂组细胞凋亡率无明显变化（P>0.05）。（2）芍药苷对H₂O₂诱导的细胞周期的影响,通过流式细胞术验证。PF 400μM预处理12h,H₂O₂诱导12h,芍药苷组较H₂O₂组S期降低,差异有统计学意义（P<0.05）;H₂O₂组较对照组,GO/G1期细胞比率明显降低（P<0.01）,S期细胞比率增高,差异有统计学意义（P<0.05）。4.芍药苷对H₂O₂诱导的细胞炎症因子表达的影响通过qRT-PCR验证。实验分为3组:空白对照组、H₂O₂组、芍药苷组（PF400μM+H₂O₂）。芍药苷预处理时间分别为12h、24h,再加入H₂O₂培养。（1）PF组先加入PF预处理12h,H₂O₂诱导4h、8h。PF组较H₂O₂组,4h、8h IFN-γmRNA表达水平明显升高（P<0.05）;IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1 mRNA表达水平无明显变化（P>0.05）。（2）PF组加入PF预处理24h,H₂O₂诱导1h、4h、8h、12h。PF组较H₂O₂组,分别于1h、8h IL-1βmRNA水平降低（P<0.05）,4h、12h IL-1βmRNA水平明显降低（P<0.01）;PF组较H₂O₂组,分别于1h、8h IL-6 mRNA水平降低（P<0.05）,4h IL-6 mRNA水平明显降低（P<0.01）;PF组较H₂O₂组,IL-8、IFN-γ、ICAM-1 mRNA水平无明显变化（P>0.05）。5.芍药苷对H₂O₂诱导的细胞上清炎症因子分泌的影响通过Elisa验证。实验分为3组:空白对照组、H₂O₂组、芍药苷组（PF 400μM+H₂O₂）。芍药苷预处理时间为24h,再加入H₂O₂培养4h、8h、12h、24h。PF组较H₂O₂组,12h IL-6表达水平明显降低（P<0.05）,其余时间点,组与组比较IL-6水平无明显变化（P>0.05）;H₂O₂组较对照组,12h ICAM-1水平明显增高（P<0.05）,其余时间点,组与组比较均无明显变化（P>0.05）;各个时间点,IL-8组与组比较均无明显变化（P>0.05）;IL-1β、IFN-γ因表达量低,未检测到。6.细胞趋化因子差异mRNA分析通过PCR array验证。PF 400μM预处理24h,H₂O₂诱导8h,PF组与H₂O₂组的PIG3V细胞表达的趋化因子mRNA进行差异分析。设定差异倍率>1.50时,认为mRNA表达上调,差异倍率<0.67时,认为该mRNA表达下调,归纳后共有10个mRNA发生上调（P<0.05）;4个mRNA发生下调（P<0.05）,分别为PPBP、GPR17、CCL5、CCR6。7.qRT-PCR、Western blot验证差异的趋化因子应用qRT-PCR验证下调差异倍率小于2的趋化因子,即PPBP、GPR17在mRNA水平的表达,发现其中只有GPR17,PF组与H₂O₂组比较有统计学差异,且在PF组表达下降（P<0.05）,与PCR array表达趋势一致。进而应用Western blot验证GPR17在蛋白水平表达,PF 400μM预处理24h,H₂O₂诱导8h、12h、24h,发现PF（400μM）可抑制H₂O₂诱导24h的GPR17表达。8.芍药苷抑制H₂O₂诱导NF-κB蛋白表达通过Western blot验证。PF 400μM预处理24h,H₂O₂诱导8h、12h、24h。H₂O₂诱导8h、12h、24h的PIG3V细胞,较空白对照组NF-κB p-p65表达升高;芍药苷抑制H₂O₂诱导24h的NF-κB p-p65表达,对NF-κB p65的表达无明显影响。9.芍药苷通过NF-κB通路抑制H₂O₂诱导GPR17表达通过Western blot验证。实验分为7组:对照组,H₂O₂组,PF、H₂O₂共同处理组,LPS、PF、H₂O₂共同处理组,PDTC、PF、H₂O₂共同处理组,LPS、H₂O₂共同处理组,PDTC、H₂O₂共同处理组。LPS或PDTC与H₂O₂共同处理12h、24h,LPS、H₂O₂组较H₂O₂组诱导的24h细胞NF-κB p-p65表达增多,PDTC、H₂O₂组较H₂O₂组诱导的24h细胞NF-κB p-p65表达抑制。综上表明LPS激动NF-κB或PDTC抑制NF-κB成功,可进行后续实验。PF对H₂O₂、LPS诱导的12h GPR17表达抑制,LPS、PF、H₂O₂共同处理组较PF、H₂O₂共同处理组GPR17表达降低;PF对H₂O₂、PDTC诱导的24h GPR17表达增强,PDTC、PF、H₂O₂共同处理组较PF、H₂O₂共同处理组GPR17表达增强。10.芍药苷通过NF-κB通路抑制H₂O₂诱导的PIG3V细胞凋亡通过流式细胞术验证。实验分为7组:对照组,H₂O₂组,PF、H₂O₂共同处理组,LPS、PF、H₂O₂共同处理组,PDTC、PF、H₂O₂共同处理组,LPS、H₂O₂共同处理组,PDTC、H₂O₂共同处理组。LPS激动NF-κB或PDTC抑制NF-κB,LPS或PDTC与H₂O₂共同处理12h,LPS、PF、H₂O₂共同处理组较H₂O₂组细胞凋亡减少（P<0.05）,较PF、H₂O₂共同处理组细胞凋亡有较少趋势,但无统计学差异（P>0.05）。PDTC、PF、H₂O₂共同处理组较H₂O₂组细胞凋亡减少（P<0.05）,较PF、H₂O₂共同处理组细胞凋亡有较少趋势,但无统计学差异（P>0.05）。11.Meta分析结果23篇文献被纳入研究,其中20个研究的样本来源是血清、血浆、红细胞、血液、皮肤或水疱液,另3个研究,分别检测两个样本源的GPx水平。所以比较总数是26。所有研究的种族都是白种人或亚洲人口。应用随机效应模型。结果表明,白癜风患者的和健康对照的GPx水平相当[SMD=-0.47,95%CI（-1.03,0.08）,P=0.095]。按样本来源亚组分析表明白癜风患者皮肤中的GPx水平高于健康对照组[SMD=1.49,95%CI（0.06,2.91）,P=0.041]和血中的GPx水平低于健康对照组[SMD=-1.06,95%CI（-2.06,-0.06）,P=0.038]。在血清[SMD=-1.24,95%CI（-2.79,0.31）,P=0.117],血浆[SMD=-0.05,95%CI（-1.43,1.34）,P=0.948],红细胞[SMD=-0.97,95%CI（-1.94,0.00）,P=0.050],或疱液[SMD=-0.29,95%CI（-1.56,0.98）,P=0.657]中无统计学差异。按种族亚组分析表明,白癜风患者亚洲人群的GPx水平低于对照组[SMD=-0.47,95%CI（-1.08,0.14）,p=0.001],但高加索人群无统计学差异[SMD=0.259,95%CI（-0.28,0.80）,P=0.346]。结果表明,与健康对照组相比,无论稳定期或进展期的白癜风患者,血清/血浆中GPx水平较低。[稳定期:SMD=-2.01,95%CI（-3.52,-0.49）,P=0.009;进展期:SMD=-2.34,95%CI（-4.07,-0.61）,P=0.008]。稳定期与进展期比较无显著性差异[SMD=0.50,95%CI（-0.02,1.01）,P=0.058]。与对照组相比,节段型白癜风患者的GPx水平较低[SMD=-3.59,95%CI（-6.38,-0.80）,P=0.012)。非节段型白癜风患者与对照组相比,无显著性差异[SMD=-2.81,95%CI（-5.71,0.10）,P=0.058]。节段型与非节段型白癜风患者比较,GPx水平无显著性差异[SMD=-0.18,95%CI（-0.47,0.11）,P=0.230]。单变量和多元回归分析用于探索可能的异质性来源。结果表明种族可能是异质性的主要来源。敏感性分析结果表明,没有个别研究显著影响汇总结果,表明统计结果稳定。结论1.高浓度芍药苷（浓度≥400μM）对PIG3V细胞的增殖有促进作用。2.芍药苷可抑制H₂O₂诱导的PIG3V细胞IL-1β、IL-6的表达、细胞凋亡、S期细胞的比例。3.芍药苷组较H₂O₂组差异表达的趋化因子共14个,其中上调的10个,下调的4个。芍药苷对H₂O₂诱导的PIG3V细胞趋化因子GPR17表达有抑制作用。4.芍药苷可抑制H₂O₂诱导的PIG3V细胞NF-κB p-p65表达。5.芍药苷可通过NF-κB通路抑制H₂O₂诱导的PIG3V细胞GPR17表达,同时抑制H₂O₂诱导的PIG3V细胞凋亡。6.GPx水平低与亚洲人群或节段型白癜风发病有关;血中低水平GPx与白癜风发病相关,无论是稳定期还是进展期。