随着世界经济的飞速发展和人们生活水平的普遍升高,饮食结构中高糖、高脂成分所占比率逐年提高,致使人类糖尿病及高脂血症的发病率逐年增加。我国作为世界上最大的糖尿病流行地,超过1.3亿的糖尿病患者给社会和家庭带来沉重的负担,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为糖尿病患者主要微血管并发症之一,已经成为终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的重要病因,与糖尿病患者的死亡率密切相关。同时脂代谢紊乱如高脂血症,也是糖尿病肾病的重要危险因素,增高的血脂可以直接沉积在肾脏中造成肾小球内皮细胞、系膜细胞等损伤,加重肾小球硬化。因此糖尿病肾病以及高脂血症伴随血糖升高、血脂异常可引起一系列肾脏病理改变,包括细胞外基质(extracellular matrix,ECM)聚集、氧化应激、炎细胞浸润等,加重肾脏纤维化(renal fibrosis)。肾脏纤维化又是所有慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)发展至终末期肾脏病的共同通路。目前认为肾脏纤维化是一个类似于损伤的愈合反应过程。在炎症损伤反应过程中,肾脏内出现单核细胞/巨噬细胞浸润和T细胞激活,活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生增多,炎细胞及促炎细胞趋化因子分泌增加,上述病理改变又通过激活肾脏系膜细胞、成纤维细胞和肾小管上皮细胞分泌大量的ECM组分,逐渐加重肾脏纤维化,最终发展至终末期肾衰竭,而使正常肾功能永久丧失。基质金属蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12,MMP-12),又称为巨噬细胞金属蛋白酶,最早是在巨噬细胞内发现的一种能够降解弹性蛋白(elastin)的金属蛋白酶。研究表明,MMP-12不仅可以降解其主要底物-弹性蛋白,而且同样可以降解其它一些ECM组分,如IV型胶原、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层粘连蛋白(laminin,LN)、Vitronectin、蛋白多糖、硫酸软骨素和髓磷脂碱性蛋白等。目前已知MMP-12可在肥厚性破骨细胞、血管平滑肌细胞、活化的肾系膜细胞和一些癌症细胞表达。MMP-12表达异常与腹主动脉瘤、动脉粥样硬化和肺气肿等疾病密切相关,但是MMP-12的表达对于糖尿病肾病和高脂肾损伤中所产生的相关病理机制还鲜有报道。目的:通过对体外培养的糖尿病大鼠肾小球系膜细胞以及DN、高脂肾损伤动物模型进行研究,观察MMP-12基因表达缺失在DN和高脂肾损伤中细胞外基质、氧化应激、炎细胞浸润等方面发挥的肾保护作用及其机制。方法:本研究利用体外培养的SD大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC),观察高糖对GMC中MMP-12基因、大鼠GMC中ECM和氧化应激相关基因和蛋白表达的影响,并通过si RNA敲低MMP-12基因的表达,观察MMP-12基因表达降低后对与肾脏纤维化密切相关的TGF-b1信号途径的影响。为阐明MMP-12的在DN中的相关机制,利用MMP-12基因敲除小鼠构建链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病肾病动物模型,探讨MMP-12基因表达缺失在DN中的肾保护作用。利用载脂蛋白E(apolipoprotein E,apo E)和MMP-12双基因敲除小鼠构建高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导的小鼠高脂肾损伤动物模型,探讨MMP-12基因表达缺失在高脂肾损伤中的肾保护作用。并同时应用荧光实时定量反转录PCR(Real Time-q PCR)、Western blot检测ECM、氧化应激和炎细胞浸润相关基因m RNA及蛋白质表达变化;应用免疫荧光染色确定相关蛋白的相互作用;应用免疫组化染色观察肾脏组织中ECM聚集、氧化应激、炎细胞浸润这三方面病理改变,最终阐明MMP-12基因表达缺失在糖尿病肾病小鼠模型和HFD诱导肾损伤小鼠动物模型中发挥的肾保护作用及其机制。结果:1 MMP-12对高糖诱导的大鼠GMC中ECM表达和氧化应激的影响1.1 SD大鼠肾小球系膜细胞分离和培养:SD大鼠GMC体外传代培养后分为三组,即正常对照组(D-葡萄糖5.5mmol/L,NG组)、甘露醇组(甘露醇25mmol/L,MG组)、高糖组(D-葡萄糖30 mmol/L,HG组)。分别于处理后的不同时间点收集细胞,提取蛋白和总RNA,Western blot和Real Time-q PCR分析MMP-2、MMP-9、MMP-12、TGF-b、FN、LN等主要的ECM、氧化应激相关基因和蛋白表达的变化;通过si RNA敲低MMP-12基因的表达观察其对肾脏纤维化密切相关的TGF-b1信号途径的影响。1.2高糖诱导SD大鼠肾小球GMC上调ECM相关基因的表达:Real time q PCR的结果表明,与NG组相比,HG处理后GMC中的MMP-2、MMP-9、MMP-12、FN和LN基因的表达均上调,其中MMP-2、MMP-9、FN和LN基因的表达于6-12 h开始升高,呈时间依赖性,MMP-2到48 h时达到峰值,72 h后表达略有下降,但仍高于NG组和MG组其他各时间观察点(P<0.05);MMP-9到24 h时达到峰值,48h、72 h后表达略有下降,但仍高于NG组和MG组其他各时间观察点(P<0.05);FN和LN到72 h时达到峰值;而MMP-12基因的表达于6 h开始升高,呈时间依赖性,到12 h时达到峰值(P<0.05),一直持续高表达至48h,72 h后表达略有下降,但仍高于NG组和MG组其他各时间观察点(P<0.05)。1.3高糖诱导GMC上调氧化应激相关蛋白的表达:Western blot结果显示,高糖能够诱导GMC表达不同类型的NADPH氧化酶(Nox),与NG组相比,HG处理后Nox2、Nox4以及亚基p67phox和p22phox的表达在48 h后达到峰值,72 h后其表达仍然高于同一时间点NG组和MG组细胞(P<0.05)。1.4敲低MMP-12基因的表达显著抑制TGF-b1的信号途径:Western blot结果显示,GMC经HG刺激后不仅显著上调TGF-b1的表达,而且促使TGF-b1(4 ng/m L,10 min)诱导的ERK1/2和Akt磷酸化增强。而si RNA敲低GMC中MMP-12基因的表达,则能够显著抑制HG上调的TGF-b1表达及其增强ERK1/2和Akt磷酸化的作用。2 MMP-12基因表达缺失在糖尿病肾病小鼠模型中发挥肾保护作用2.1 WT组小鼠和MMP-12-/-组小鼠生化指标和肾功能指标的变化:MMP-12基因敲除小鼠和相同遗传背景的C57BL/6J(WT)小鼠腹腔一次性注射STZ(175 mg/kg)制备DN动物模型,造模成功后八周检测小鼠生化指标和肾功能指标的变化。WT组小鼠和MMP-12-/-组小鼠无论是对照组(NC)还是糖尿病肾病组(DN)体重和血压无显著差异,但是DN组的血糖水平显著高于NC组(WT组,DN小鼠288.4±14.3 vs NC 128.6±13.6,P<0.05;MMP-12-/-组,DN小鼠245.3±11.7 vs NC 134.9±14.1,P<0.05),该结果表明,MMP-12基因敲除能够显著抑制STZ诱导血糖升高(MMP-12-/-组,DN 245.3±11.7 vs WT DN 288.4±14.3,P<0.05)。DN组同NC组相比,24小时尿白蛋白排泄(albumin excretion,mg/24 h)、血肌酐(SCR)和尿素氮(BUN)显著升高(P<0.05),表明此时糖尿病肾脏病变加重,肾功能受损,但是MMP-12-/-组中DN小鼠同WT组中DN小鼠相比,24小时尿白蛋白排泄、SCR和BUN水平有显著降低,表明MMP-12表达缺失能够部分逆转STZ诱导的肾损伤,对DN产生一定的肾保护作用。2.2 MMP-12的表达与肾损伤程度密切相关:PAS染色结果表明,STZ诱导8周后,WT组中DN小鼠肾小球体积显著增大、系膜基质增多、基底膜增厚。MMP-12-/-组中DN小鼠同WT组DN小鼠相比,肾脏病变程度明显减弱。同时免疫组化染色结果显示,WT组中DN小鼠肾小球部位MMP-12阳性染色颗粒明显增多,表明MMP-12的表达和肾小球病变程度具有正相关性。2.3 MMP-12缺失抑制STZ诱导肾小球细胞外基质聚集和促炎相关基因的表达:Real time q PCR结果显示,MMP-12-/-组DN小鼠肾组织中MMP-12、MMP-2和MMP-9基因的转录水平较WT组DN小鼠表达显著降低;MMP-12-/-组DN小鼠肾组织中TGF-b1及其下游FN和LN等纤维化相关基因表达均较WT组的DN小鼠显著下调;MMP-12基因缺失同时抑制了肾小球单核细胞/巨噬细胞标记分子单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)和CD11b的表达。2.4 MMP-12缺失逆转在肾小球STZ诱导的巨噬细胞浸润:免疫组化结果表明,与WT组NC小鼠相比,WT组DN小鼠肾小球区域能检测到较强的CD68阳性染色颗粒,而在MMP-12-/-组DN小鼠肾小球中CD68的表达却显著低于WT组DN小鼠,Real time q PCR结果也同时证实了CD68转录水平和蛋白水平具有相同的变化趋势。2.5 MMP-12缺失抑制STZ诱导的肾小球氧化应激:Western blot结果表明WT组中,STZ诱导DN小鼠肾小球中Nox4和p67phox表达显著增加,而MMP-12表达缺失能够显著降低肾小球中Nox4和p67phox的表达。STZ的诱导作用通常是通过激活上游的MCP-1和TGF-b的表达来完成的。同WT组对照小鼠相比,STZ诱导WT组DN小鼠肾小球中MCP-1和TGF-b的表达及其下游信号分子ERK1/2和Akt的磷酸化显著增加,而MMP-12表达缺失能够逆转STZ对这两种促氧化应激蛋白的表达和下游信号分子的磷酸化的促进作用。3 MMP-12基因表达缺失在高脂肾损伤小鼠模型中发挥肾保护作用3.1 MMP-12缺失逆转HFD诱导的肾损伤:HFD饲养apo E-/-和apo E-/-MMP-12-/-小鼠不同时间点后生化指标显示,apo E-/-和apo E-/-MMP-12-/-小鼠的体重、血压、总胆固醇、甘油三酯、HDL和LDL水平在各组无明显差异。同正常饮食小鼠相比,反映肾功能指标的24小时尿蛋白定量和血清肌酐浓度在HFD后第6和第9个月显著增高,但是apo E-/-MMP-12-/-小鼠HFD组这两个指标显著低于同时间点HFD组的apo E-/-相小鼠,该结果表明MMP-12缺失能够部分逆转HFD诱导的肾脏损伤。3.2 HFD诱导肾小球MMP-12的表达:免疫组化和Real-time q PCR结果显示,在HFD诱导的apo E-/-小鼠中,MMP-12阳性染色颗粒随HFD处理时间的延长呈持续增多的趋势;肾小球MMP-12 m RNA水平通过q RT-PCR进行分析,结果显示了相同的变化趋势。3.3 MMP-12缺失抑制HFD诱导的肾小球胞外基质聚集和促炎相关基因的表达:免疫组化和Real-time q PCR技术显示,HFD能够诱导apo E-/-小鼠FN和IV型胶原在肾组织的持续表达,而MMP-12缺失则可逆转HFD诱导的FN和IV型胶原的表达上调过程;Real-time q PCR结果表明,HFD处理3个月后apo E-/-小鼠肾脏纤维化标记基因TGF-β1,炎症相关基因MCP-1和CD11b的m RNA水平显著增加,而apo E-/-MMP-12-/-小鼠肾小球中这两类基因的m RNA水平显著低于同时间点的apo E-/-小鼠;3.4 MMP-12缺失逆转HFD诱导的巨噬细胞在肾小球的募集和浸润:免疫组化和Real-time q PCR结果显示,apo E-/-小鼠肾小球巨噬细胞募集和浸润在HFD处理后3、6、9个月持续表达增强,而MMP-12缺失可以抑制HFD诱导的巨噬细胞在肾小球的募集和浸润。3D胶细胞体外侵染实验进一步表明,MMP-12缺失能够拮抗或抑制HFD诱导的巨噬细胞募集和浸润过程。免疫荧光染色后应用激光共聚焦显微镜观察,结果显示肾小球MMP-12是由募集和浸润的巨噬细胞分泌或是由损伤导致的活化系膜细胞分泌。3.5 MMP-12缺失抑制HFD诱导的肾小球氧化应激过程:Western blot结果显示HFD能够诱导apo E-/-小鼠Nox4和p67phox的持续表达,而MMP-12缺失则逆转HFD诱导的Nox4和p67phox的表达上调过程。对其信号途径的研究表明,HFD诱导的apo E-/-小鼠肾小球中ERK1/2和Akt的磷酸化水平在3-6个月时显著增强,但这种影响可在MMP-12表达缺失时而被显著抑制。结论:1高糖可以诱导肾小球系膜细胞中MMP-12、细胞外基质组分、促炎因子及氧化应激等相关基因的表达上调;2敲低MMP-12基因的表达显著抑制与肾脏纤维化密切相关的TGF-?1的信号途径;3 MMP-12基因表达缺失可以通过降低FN、LN、IV型胶原减少细胞外基质聚集,通过减少NADPH氧化酶表达抑制氧化应激,通过降低促炎因子表达抑制炎细胞浸润,进而在STZ诱导的糖尿病肾损伤小鼠动物模型及HFD诱导的高脂肾损伤小鼠动物模型中发挥肾保护作用。