骨形态发生蛋白（BMP）是机体促进骨形成的重要因子，BMP-2/4/6/7/9这些家族成员均在间充质干细胞（MSC）向成骨细胞的分化过程中有着重要的作用。目前，重组的人源BMP-2（rhBMP-2）已经获得美国FDA认证，成为用于骨折后康复的蛋白类药物。但是，由于纯化难度大、剂量需求高，无法实现大规模的生产，从而难以降低治疗成本。目前，临床使用的骨质疏松治疗药物如阿仑磷酸盐、雌激素受体调节剂、活性维生素D、雌激素替代治疗、降钙素等都是基于针对破骨细胞的调控来抑制骨吸收，但是对于已经丢失的骨量无法恢复。唯一被美国FDA批准用来通过刺激新骨形成来恢复丢失的骨量的治疗药物就是甲状旁腺激素（PTH）。然而，这种药物在刺激骨形成的同时也刺激了骨吸收。所以对于增强骨形成能力，目前尚无较有效的疗法。本课题希望通过拮抗BMP通路的负调控因子Smurf1（Smad ubiquitylation regulatory factor1）的活性，使得信号通路的效应增强，从而达到提高前体细胞向成骨细胞的分化能力。泛素化是蛋白质翻译后的重要修饰之一，它可以改变被泛素化修饰的底物的功能或亚细胞定位，或将底物送去蛋白酶体进行降解。其中，泛素-蛋白酶体（UPS）途径可以特异性地消灭细胞内特定生理条件下需要降解的蛋白质，对维持正常生理功能发挥重要作用。在泛素化过程中，泛素分子经过泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）的逐级传递，最后被催化连接到底物蛋白的赖氨酸上，并进一步形成泛素链。E3分为HECT类和RING类两种，它们的底物的特异性和选择性决定了蛋白质泛素化的多样性。Smurf1是一个HECT类的泛素连接酶，从属于NEDD4超家族。研究发现Smurf1广泛参与骨动态平衡、免疫调节、肿瘤发生发展及神经系统发育等重要的生理、病理过程。基于Smurf1基因敲除小鼠的研究发现，敲除Smurf1引起的表型主要是小鼠骨量的提升和骨形成特异增加。生理条件下Smurf1的功能主要是抑制骨形成、下调骨量。Smurf1的转基因小鼠有明显的骨量下降的表型，而敲除Smurf1的激活因子CKIP-1的小鼠则出现随年龄增长的骨密度升高。虽然Smurf1更多的功能仍在不断地被揭示，其对于骨形成的负调控作用使得它有资格成为新型促进骨形成药物的作用靶点。Smurf1可以通过负调控BMP信号通路来影响前体细胞的成骨分化。机制是：当BMP结合细胞表面的受体后，与受体偶联的Smad1和Smad5（Smad1/5）被激活，并与Smad4形成转录复合体后入核激活下游靶基因的转录。在这一过程中，Smad1/5先后被蛋白激酶CDK8/9和GSK3两次磷酸化，从而被Smurf1识别并且泛素化修饰，使之被26S蛋白酶体降解，从而阻断信号通路。而介导Smurf1识别、结合Smad1/5的关键结构域是其分子内的两个WW结构域。其中WW1结构域可以特异性结合Smad分子的双磷酸化区域，WW2结构域可以结合Smad分子的PY基序。我们通过分析以报道的Smurf1与激活状态的Smad1相互作用区域的结构特征，推测Smurf1的WW1结构域和Smad1激活后双磷酸化的铰链区域的结合决定了Smurf1和Smad1结合的特异性。基于已有的结构信息，我们定义了Smurf1的WW1结构域介导这个相互作用的关键疏水口袋。同时，为了从多种策略达到拮抗Smurf1的目的，我们通过Smurf2的HECT结构域已报道的结构同源建模得到Smurf1的HECT结构域的模拟结构，分析了Smurf1的HECT结构域结合泛素分子的关键区域，进行了疏水口袋定义。我们运用eHiTS软件，将各个口袋与大约100万个可购买化合物进行了计算机虚拟对接。进一步的实体化合物筛选，我们选择了Smurf1结合Smad1区域的对接结果，我们进行了受体与配体的结合模式分析，并以软件打分和化合物骨架聚类为原则选择了其中19个化合物进行细胞学实验验证。以细胞碱性磷酸酶(ALP)活性作为筛选标准，我们最终选择了A01和A17号化合物作为候选化合物。经过进一步实验验证，我们发现A01和A17可以稳定细胞内Smad1/5的蛋白量，延长其蛋白半衰期，而并不影响Smad1/5的mRNA水平；其机制是A01和A17可以阻止Smurf1和Smad1的相互作用，从而阻止了Smurf1介导的Smad1/5泛素化。并且，A01和A17对于非Smurf1介导的Smad1/5蛋白水平降低没有稳定作用。我们发现，A01和A17对Smad1/5蛋白量的稳定依赖于BMP通路的激活，而且对于Smurf1在其他通路的底物（如RhoA，ING2）没有明显影响。A01和A17可以提高前体细胞对于BMP-2信号的响应，上调成骨相关靶基因的表达；另外，A01和A17可以提高细胞基质的钙离子和ALP的累积，增强细胞的增殖能力，并且具有较小的细胞毒性。我们的研究表明了A01和A17通过拮抗Smurf1对Smad1/5的泛素化降解来稳定Smad1/5的蛋白水平，从而使前体细胞可以对BMP信号持续响应，增强了前体细胞成骨分化的能力。虽然目前治疗以骨质疏松症为代表的骨量减少性骨病的方法不胜枚举，但促进骨形成的药物仍是少数；另外，靶向泛素-蛋白酶体的药物和通过靶向拮抗细胞内效应蛋白的药物还未曾应用到这类疾病的治疗之中。对于特定功能蛋白的靶向拮抗或是激活可以大大降低药物成药后的副作用，而通过不同作用机制的同一用途的药物可以在联合使用后发挥更明显的效用。新型骨生成负调控因子抑制剂的研发可以在不取代现有药物的基础了作为联合用药的候选项。我们的工作提出了一种研发骨形成促进剂的新思路，建立了的基于计算机模拟对接的E3拮抗剂筛选的新方法，并通过实验证明了Smurf1在增强BMP通路活性中作为药物靶点的可行性，并且拓展了UPS抑制剂在治疗骨质疏松中的潜在应用前景。