肿瘤细胞所需要的能量主要由葡萄糖氧化供应,而肿瘤细胞的糖代谢较相应的正常细胞有很大差异,其主要表现是糖酵解显著增强,且肿瘤的恶性程度越高,这种趋势就越明显。以3-溴丙酮酸为代表的以抑制糖酵解限速酶为作用靶点的糖酵解酶抑制剂,在抗肿瘤领域的研究取得了突破性进展,尤其是它对肝癌细胞抑制作用的研究取得了令人可喜的成果。但作为抗肿瘤药物,3-溴丙酮酸的研究尚处于初级阶段,国内目前尚未见到3-溴丙酮酸抗肿瘤作用的研究报道。在国外,其抗肿瘤作用的研究也仅限于对肝癌等少数肿瘤进行了体外肿瘤细胞增殖抑制实验、以及采用肝癌动物模型瘤内介入给药和荷瘤动物瘤内直接注射给药等方法观察其体内抗肿瘤作用等;在抗肿瘤作用机制方面,则主要针对糖酵解能量代谢开展了一定的研究。而关于3-溴丙酮酸对其他肿瘤的抑制作用如何?是否存在其他的抗肿瘤作用机制以及反复多次给药对机体有怎样的不利影响,国外也极少或未见报道。本研究旨在国外学者研究成果的基础上,利用现代细胞生物学、分子生物学技术,病理学和毒理学等方法,对3-溴丙酮酸抗肿瘤作用进行体外筛选;同时,就3-溴丙酮酸对人乳腺癌细胞(MCF-7)和人结肠癌细胞(SWIII-C)的生长抑制作用进行进一步研究,从细胞周期、细胞超微结构和基因水平进一步探讨3-溴丙酮酸抗肿瘤作用机制;采用不同的给药模式,观察并评价3-溴丙酮酸不良反应及安全性,为颇有前途成为抗肿瘤新药的3-溴丙酮酸的研究与开发提供理论及实验依据。第一部分3-溴丙酮酸抗肿瘤作用目的:筛选与评价3-溴丙酮酸体外抗瘤谱。方法:利用MTT法,检测3-溴丙酮酸对9种人肿瘤细胞的抑制作用。结果:通过MTT法检测发现3-溴丙酮酸对9种人肿瘤细胞均有体外生长抑制作用,其IC50值在6.44μg/ml～20.78μg/ml之间。其中对人子宫内膜癌HEC-1B细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人胶质瘤U251细胞的IC50小于10μg/ml。小结:3-溴丙酮酸具有广谱的体外抗肿瘤作用。第二部分3-溴丙酮酸抗肿瘤作用机制研究目的:研究3-溴丙酮酸对SWIII-C和MCF-7细胞增殖、细胞形态学及超微结构、细胞周期分布和细胞凋亡率的影响及对bcl-2、c-myc和mtp53蛋白表达的影响。方法:利用透射电镜、MTT法、流式细胞仪、病理学等方法检测3-溴丙酮酸对肿瘤细胞的作用。结果:⑴对SWIII-C和MCF-7细胞增殖的影响3-溴丙酮酸对SWIII-C细胞和MCF-7细胞有生长抑制作用。25μg/ml～100μg/ml的3-溴丙酮酸对SWIII-C和MCF-7细胞的增殖具有明显抑制作用,浓度为25μg/ml时抑制作用最明显,继续增加药物浓度,抑制作用不再增加。⑵对SWIII-C和MCF-7细胞形态学及超微结构的影响两种细胞常规培养,各加入25μg/ml的3-溴丙酮酸处理,收集细胞,固定、包埋、制片、染色,透射电镜观察。电镜下结果显示,正常细胞形态结构规则,染色质分布均匀,细胞膜完整。3-溴丙酮酸作用48h后,凋亡细胞呈现核固缩,染色质边集于核膜附近呈新月状分布,形成不同形状和大小的块状,胞浆内有大量颗粒、空泡等,边界清楚,细胞膜完整。⑶对SWIII-C和MCF-7细胞周期分布和细胞凋亡率的影响两种细胞常规培养,以相应浓度3-溴丙酮酸处理48小时,收集细胞,PI染色,流式细胞仪测定细胞周期时相分布及细胞凋亡率。结果显示,低浓度3-溴丙酮酸不能有效诱导细胞凋亡。浓度在25μg/ml～100μg/ml之间可有效诱导细胞凋亡,且浓度为25μg/ml效果最明显。细胞周期分析结果表明,3-溴丙酮酸处理SWIII-C细胞后,随着药物浓度的增加,与对照组比较,G0/G1期和S期细胞比例降低,G2/M期细胞比例增加;而处理MCF-7细胞后,G0/G1期细胞比例减少,S期细胞小剂量比例增加、大剂量比例降低,G2/M期细胞比例增加。说明3-溴丙酮酸可主要将肿瘤细胞阻滞于细胞增殖的有丝分裂期和DNA合成后期。⑷对SWIII-C细胞和MCF-7细胞bcl-2、c-myc和mtp53基因蛋白表达的影响常规进行细胞培养,以25μg/ml 3-溴丙酮酸处理96h,收集细胞,涂片,SP试剂盒说明书操作染色,镜检,进行数据分析。免疫组化的结果显示,在细胞浆或细胞核中可见有颗粒样分布深浅不一的棕黄色物质。未用3-溴丙酮酸处理的SWIII-C细胞和MCF-7细胞bcl-2、c-myc和mtp53基因高度表达,经3-溴丙酮酸处理后的SWIII-C细胞和MCF-7细胞bcl-2、c-myc和mtp53基因表达明显降低,说明3-溴丙酮酸可下调肿瘤细胞bcl-2、c-myc和mtp53基因蛋白表达。小结:(1)3-溴丙酮酸对SWIII-C和MCF-7细胞具有明显的抑制作用,浓度为25μg/ml时抑制作用最佳。(2)3-溴丙酮酸通过阻滞肿瘤细胞有丝分裂和DNA合成过程而诱导其凋亡,凋亡与该药物下调细胞bcl-2、c-myc和mtp53基因蛋白表达相关。第三部分3-溴丙酮酸安全性评价目的:评价3-溴丙酮酸的安全性。方法:利用毒理学和病理学方法,检测大鼠血液系统及血清相关生化指标;检测家兔耳缘静脉注射3-溴丙酮酸后器官组织形态及骨髓造血功能。结果:(1)对实验动物一般状况的影响实验动物对3-溴丙酮酸的耐受性较好,注射部位损害较轻。(2)对大鼠血细胞数量及血清中相关生化指标的影响正常大鼠尾静脉注射3-溴丙酮酸0.55mg/kg,对照组注射等体积的生理盐水,每天1次,连续7d,采血,检测血液系统及血清中相关生化指标。结果表明,连续注射一周后,大鼠一般状况差,外周血细胞三系减少,同时血清中ALT、Urea、Glob、γ-GT升高,而Glu有所降低。(3)对家兔主要器官组织形态的影响正常家兔耳缘静脉注射3-溴丙酮酸,设两种给药剂量和给药模式,第一种模式: 1.1mg/kg,一次性注射,观察7d,而后取检查标本;第二种模式:0.55mg/kg,每周注射1次,连续4周,而后取检查标本。以4mg/kg和2mg/kg顺铂为两个给药模式阳性对照组,生理盐水为正常对照组。结果发现,一次性大剂量注射3-溴丙酮酸组家兔一般状况良好;顺铂组有2只死亡,其余家兔体重减轻。小剂量每周1次,维持4周,3-溴丙酮酸组1只于第3周死亡,其余及顺铂组全部家兔一般状况良好。两种给药模式的主要脏器组织形态学光镜下结果显示:3-溴丙酮酸组胸腺、脾脏、心脏、肺脏、胰腺、肾上腺、胃、十二指肠、子宫、睾丸均未见异常形态学改变。但肝脏和肾脏出现不同程度的形态学改变。与注射相应剂量(4mg/kg)顺铂组对比大剂量一次性注射3-溴丙酮酸,家兔出现肾小球毛细血管和肾间质充血的几率由75%降至66.7%,家兔出现肝细胞浆疏松水肿的几率由50%降至33.3%;小剂量每周1次,维持4周,存活的3-溴丙酮酸组中60%出现肾小球毛细血管和肾间质充血,100%出现肝细胞浆疏松水肿;顺铂组83%出现肾小球毛细血管和肾间质充血,50%出现肝细胞浆疏松水肿,其中1例肝组织呈慢性炎症性改变。顺铂组中有50%睾丸曲细精管中生精细胞层数及密度与3-溴丙酮酸组和正常对照组比较略显减少。(4)对家兔骨髓造血功能的影响骨髓象检查结果显示,大剂量一次性注射3-溴丙酮酸组家兔33.3%的骨髓象正常,50%出现有核细胞增生活跃,但退化细胞明显的轻微骨髓抑制现象,16.7%出现有核细胞增生减低,造血细胞明显减少,纤维细胞增多的明显骨髓抑制现象;顺铂组75%呈正常骨髓象,25%出现有核细胞增生减低,造血细胞明显减少,纤维细胞增多的骨髓抑制现象。小剂量每周1次,维持4周后,3-溴丙酮酸组60%出现有核细胞增生活跃,造血细胞多见,脂肪空泡明显,巨核细胞少见的骨髓象,40%出现明显的骨髓抑制现象;顺铂组家兔83%出现明显的骨髓抑制现象,17%呈现有核细胞增生活跃,造血细胞多见,巨核细胞少见的骨髓象。(5)对家兔血细胞数量和肝肾功能的影响两种剂量及给药模式对家兔RBC、WBC数量和Hb含量没有明显影响,但对PLT而言,两种剂量及给药模式均可使其数量明显减少。两种给药结果表明,随着3-溴丙酮酸的蓄积,家兔的肝肾损害逐渐加重,血清中ALT和Urea含量逐渐增高。小结:(1)实验动物对3-溴丙酮酸的耐受性较好,一般状况良好,给药部位损害较轻。(2)不同给药模式对实验动物血细胞数量的影响及程度不同,小剂量连续给药1周可导致严重的血细胞三系减少;大剂量一次性给药和小剂量每周1次、维持4周只出现血小板明显减少,红细胞、白细胞数量没有明显变化。(3)随着药物的蓄积,动物的肝肾损害逐渐加重,血清中ALT和Urea含量逐渐增高,且肾功能改变较大。(4)不同给药模式给3-溴丙酮酸后,家兔胸腺、脾脏、心脏、肺脏、胰腺、肾上腺、胃、十二指肠、子宫、睾丸均未见异常形态学改变,一定比例的家兔肝脏和肾脏出现不同程度的形态学改变。(5)不同给药模式给3-溴丙酮酸后,一定比例的家兔出现骨髓造血功能抑制现象,且对巨核细胞的增生抑制作用明显。结论:1. 3-溴丙酮酸具有较强的广谱体外抗肿瘤作用。2. 3-溴丙酮酸对SWIII-C和MCF-7细胞的生长具有明显的抑制作用,浓度为25μg/ml时抑制作用最佳。3-溴丙酮酸通过阻滞肿瘤细胞有丝分裂和DNA合成过程而诱导其凋亡,凋亡与该药物下调细胞bcl-2、c-myc和mtp53基因蛋白表达相关。3.大鼠和家兔的长期毒性试验表明,3-溴丙酮酸具有相对较高的安全性。