论文部分内容阅读
研究背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以侵蚀性关节炎为主的慢性高致残性自身免疫性疾病。其病理特征为关节滑膜的慢性炎症,以及由此导致的关节软骨及骨的破坏。目前RA的治疗药物主要包括：非甾体抗炎药(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs, NSAIDs),缓解病情抗风湿药(disease-modifying antirheumatic drugs, DMARDs)以及近二十年来出现的生物制剂。临床医生发现,虽然经过正规早期联合多种DMARDs药物治疗,仍有部分RA患者疗效不佳；或者随着治疗时间的延长,药物疗效逐渐减弱,患者对治疗药物无反应或低反应。这些现象的发生被认为与多药耐药(Multiple Drug Resistance, MDR)的形成有关。MDR现象最早发现在肿瘤性疾病中,并且已经有了较深入的认识。而它在RA等自身免疫性疾病中的研究才刚刚起步,其具体机制尚不明确。目前国内外研究证实,MDR的一个重要机制是跨膜转运蛋白介导的药物排出增加,导致细胞内药物浓度降低。而P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)是其中最重要的一个转运蛋白,它的作用底物非常广泛,除了抗肿瘤药物、抗生素类药物之外,还包括多种DMARDs药物。国外的研究和我们之前的研究显示在耐药的RA患者的滑膜组织和外周血淋巴细胞中P-gp的表达明显增高,提示P-gp参与了RA的耐药。而P-gp由多药耐药基因-1(Multidrug resistance gene-1, MDR-1)所编码。我们猜测MDR1基因的突变或者其表达水平的改变可能会通过影响P-gp的表达及活性改变疾病对药物的反应性。因此,我们从MDR1基因入手研究其与RA中多药耐药的关系。第一章MI)R1基因多态性与类风湿关节炎多药耐药的相关性研究目的：探讨我国湖南地区汉族人群MDR1基因多态性与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)多药耐药的相关性。方法：收集来自湖南地区204例使用两种以上缓解病情抗风湿药(disease-modifying antirheumatic drugs, DMARDs)治疗半年以上的RA患者以及104例正常对照的外周血,其中204例RA患者根据美国ACR20缓解标准将其分为两组：112例治疗有效组和92例耐药组。利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测两组RA患者以及正常对照组MDR1基因G2677T/A和C1236T位点的多态性。结果：1. G2677T/A和C1236T基因型及等位基因的分布频率在正常人和RA治疗有效组之间均无明显差异(P>0.05)；2.与RA治疗有效组相比,RA耐药组中携带2677TT基因型的患者较少(P=0.014)；3.C1236T基因型及等位基因的分布频率在RA治疗有效组及RA耐药组中间无明显差异(P>0.05)。结论：1.在湖南地区汉族人群中,MDR1基因G2677T/A和C1236T位点的多态性与RA易感性无明显关联；2.在湖南地区汉族人群中,耐药的RA患者中携带MDR12677TT基因型的人数明显少于治疗有效的RA患者,提示2677TT基因型可能是RA治疗中药物耐药的保护因素。3.在湖南地区汉族人群中,MDR1基因C1236T位点的多态性与RA的多药耐药无明显关联。第二章MDR1基因高表达与RA多药耐药的相关性研究目的：体外模拟高表达MDR1的人RA滑膜耐药细胞模型R1,进一步深入探讨MDR1介导的RA中多药耐药的分子机制。方法：1.体外利用重组腺病毒Ad-EGFP-MDR1感染人RA滑膜细胞,获得RA/MDR1细胞。2.利用Real-time PCR和Western blot法检测RA/MDR1细胞MDR1基因转录水平及其编码产物P-gp蛋白的表达水平。3.采用罗丹明123外排实验验证RA/MDR1细胞外排罗丹明123功能,MTT法检测RA/MDR1细胞对甲氨蝶呤(MTX)的耐药性。结果：1.RA滑膜细胞感染重组腺病毒Ad-EGFP-MDRl72小时后,可见RA/MDR1细胞内颗粒增加,细胞体积变大,生长速度变慢,荧光下可见明显绿色荧光出现,感染率大于90%。2.Real-time PCR和Western blot检测结果显示,相对于阴性病毒对照组细胞,RA/MDR1细胞MDR1的基因转录及蛋白表达水平均有显著增加(p<0.01；p<0.05).3.RA/MDR1细胞外排罗丹明123能力较阴性病毒对照组细胞明显增强(p<0.01)；MTX各个浓度对RA/MDR1细胞的抑制率均低于对阴性病毒对照组细胞(p<0.05或p<0.01),且RA/MDR1细胞对MTX的耐药性增加了37.36倍。结论：体外成功模拟高表达MDR1的人RA滑膜耐药细胞模型——RA/MDR1;MDR1高表达可能通过上调P-gp的表达影响RA滑膜细胞对MTX的外排能力,从而影响RA滑膜细胞对药物的反应性。