持续的严重感染是临床常见的病症。例如创伤、烧伤、休克等所致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)通常伴有持续严重的内毒素血症，引起爆发性炎症反应，导致低血压、局部组织缺血和器官功能衰竭，如处理不及时则常导致病人死亡。这类病人具有明显特异性免疫功能低下的特征，这也是感染难以控制的原因之一，但其与持续严重内毒素血症的关系及具体机制尚不清楚。 内毒素(endotoxin)是存在于革兰氏阴性细菌胞壁外膜中的一种生物活性成分，在革兰氏阴性细菌感染的发病机制中起十分重要的作用，其主要毒性成分是脂多糖(lipopolysaccharide LPS)。LPS可以作用于抗原提呈细胞(antigen presenting cells APCs)，例如树突状细胞(dendritic cells，DCs)、单核巨噬细胞等，促使它们合成和分泌多种细胞因子和炎症介质，从而使机体产生多种病变，乃至感染性休克。 DC是目前已知的功能最强的专职抗原提呈细胞，具有刺激初始T细胞增殖的独特功能。DC按来源可分为髓样DC(myeloid DC)和淋巴样DC(lymphoid DC)，分别由骨髓CD34~+干细胞、外周血单核细胞以及淋巴细胞等在粒—巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage clony-stimulating factor，GM-CSF)的诱导下分化而来。出于容易诱导和扩增的原因，目前对于DC的研究主要集中在髓样DC，我们亦是以髓样DC为研究对象。成熟的DC表达高水平的Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHC-Ⅱ)、共刺激分子(CD80、CD86)以及某些粘附分子等。成熟的DC还可将抗原提呈给T细胞，从而活化T细胞，启动免疫应答。基于DC的重要功能和在机体特异性免疫中居于的关键地位，我们设想持续严重感染时的LPS刺激可能会影响DC的分化发育和功能的成熟，从而影响机体的特异性免疫功能。 我们用本室已建立的方法分离小鼠骨髓细胞，用GM-CSF诱导其中CD34~+的干细胞分化成不成熟的BMDC。在此过程中用LPS持续刺激作为试验组， 第二军医大学硕士学位论文以模拟体内持续严重感染时LPS长期存在对DC成熟状态的影响；同时在培养过程中不加 LPS作为阴性对照，在培养的最后二天加入LPS作为一次性单次刺激的对照。培养7天后进行下述实验：①观察细胞形态的差异；②流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力：③＊＊ISA检测细胞产生的细胞因子；④混合淋巴细胞培养检测细胞提呈抗原的能力：⑤H。e。他o3258检测细胞凋亡水平：③用Western－blot检测信号转导分子的表达水平。结果如下： 一、LPS的持续刺激对DC表型和功能的影响。 大量研究证实，用一定剂量的LPS短期刺激不成熟的DC，可以诱导DC成熟。成熟DC表现为细胞突起增多，变长，胞浆中吞噬小泡减少，而溶酶体丰富，核呈分叶状；MHC－11、CD86、CD80、CD等表面分子表达升高；摄取抗原的能力较弱，刺激同种异基因淋巴细胞增殖能力增强。我们的研究发现，在用＊M－＊SF诱导骨髓干细胞向＊C分化的早期即持续予以1卜咖1＊PS刺激，可以影响DC形态、表型和功能的成熟，DC呈现不成熟状态：胞膜皱稻和突起少且钝；表达MHC－11、CD86、CD80、CDllC较成熟DC明显降低；摄取抗原（FITC标记的卵清蛋白）的能力较强；刺激同种异基因小鼠 T细胞增殖的能力明显较弱；向同基因T细胞提呈抗原并刺激其增殖的能力也较弱。我们又进一步检测了LPS持续刺激对DC分泌细胞因子的影响，结果发现LPS持续刺激的DC产生TNFa，n1 印70）明显较LPS单次刺激组少。以上结果提示，LPS持续刺激可维持DC处于不成熟状态。 二、LPS抑制DC成熟的机制。 我们又进一步探讨了持续LPS刺激维持DC于不成熟状态的可能机理。我们首先考虑是否由于成熟DC大量死亡仅保留不成熟DC。用Hoechst33258检测发现，LPS短期刺激发育晚期的DC，会导致DC细胞核出现大量荧光，而受LPS持续刺激的DC胞核仅出现少量荧光。因而提示，LPS持续刺激DC井不会导致DC大量死亡。 在信号转导方面，目前认为LPS是通过DC细胞膜上Toll样受体4（hR4）发挥作用的。TLR4可直接或间接地激活细胞内MAPK、PKC以及NF．h等多种信号转导通路，来调节细胞分化、生长、凋亡等作用。大量研究证实，LPS短期刺激不成熟DC，可以活化W－IcB。活化的NF－h家族成员进入细胞核， 4 第二军医大学硕士学位论文结合在某些基因操纵子的NF．oh基序上，从而启动相关基因转录，促使DC成熟。我们则从其余两条信号转导途径入手，用Western—Blot方法检测了PKCa、pl、pZ、5、S、n和＜亚型以及MAPK途径的ERKI、ERKZ和p38MAPK的表达，发现仅 PKC个在 LPS持续刺激的 DC中表达降低，而未能检出其余各分子的明显变化。提示，LPS持续刺激 DC导致的 DC成熟受抑制与 PKC十有关。 综上所述，本实验研究了在LPS持续刺激下，DC的表型和功能的变化，发现LPS持续刺激分化发育中的DC，会抑制DC的成熟和抗原提呈功能的发挥。而这种?