阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)又称老年痴呆,是以记忆和认知功能障碍为主要特征的中枢神经系统退行性病变。β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)在脑内大量沉积已经被认为是AD致病的最基础诱发因素,然而Aβ的神经毒性机制尚未完全阐明。最近研究发现,神经炎症反应在AD病理学发展方面起到了关键的调节作用。在AD病理学改变的早期阶段,AD患者脑内易感区域即开始表达上调炎症基因并大量合成炎症细胞因子。大量的流行病学和随访性实验研究证实抑制神经炎症反应能够降低AD的发病风险。神经炎症反应逐渐被认为是诱发或加重AD发展的另一个重要潜在影响因素。星形胶质细胞在中枢神经系统中是数量最为庞大的一类功能调节细胞。在正常生理条件下,星形胶质细胞为神经元提供必要的营养和信息加工支持,积极参与维持脑内环境稳定。然而,当星形胶质细胞被异常活化后会大量生成释放炎症调节因子,包括促炎症细胞因子、生长因子、补体化合物、趋化因子等,特别是IL(interleukin)-1β,IL-6,TNF(tumor necrosis factor)-α等神经炎症调节因子的分泌,能够诱发或加重脑疾病的发展恶化。异常活化的星形胶质细胞已经成为影响神经系统功能稳定的一大不安因素。值得注意的是,在AD患者的大脑皮层和皮层下结构出现大量异常活化的星形胶质细胞。这些活化的星形胶质细胞聚集于AD患者脑内淀粉样蛋白和神经纤维缠节周围,并产生促炎症调节因子。这已经构成了AD发病早期出现的重要病理学现象。这就提示我们,调节星形胶质细胞功能可能成为治疗大脑神经炎症反应的重要靶点。然而,Aβ诱发星形胶质细胞活化后神经炎症反应发生的分子机制尚未完全阐明。因此,全面深入研究神经炎症在AD发病中的致病机制,研发有针对性的AD治疗药物将具有重要现实意义。神经甾体是具有神经保护活性的甾体类物质,主要由胶质细胞和神经元在各种甾体生成酶的作用下经胆固醇或自外周循环进入神经系统的各种前体合成分泌而成。大量研究表明神经甾体不仅参与调节神经系统的发育,还对神经系统具有营养支持以及促进神经发生和增加神经元存活等作用。神经甾体孕酮(progesterone,pg)作为内源性神经活化甾体,在调节神经细胞功能上作用明显。bashour等发现,孕酮可以快速的抑制gnrh神经元的活性,调控神经元轴突的生长,调节神经营养因子bdnf的合成与释放。值得注意的是,当皮下注射给予ad模型大鼠孕酮后发现,孕酮能显著改善ad模型大鼠的学习与记忆功能,然而其对于ad的神经保护性机制尚需要进一步阐明。本实验室前期的研究发现,孕酮能够抑制aβ诱导的神经元线粒体相关性凋亡,但是对于孕酮调节星形胶质细胞功能上的作用尚不得而知。星形胶质细胞作为中枢系统中重要的神经炎症调节细胞,维持其功能稳定对于调节脑内神经炎症反应方面起着重要的作用。本课题以原代培养的大鼠皮层星形胶质细胞为实验基础拟采用aβ体外诱导星形胶质细胞过度活化构建ad神经炎症细胞模型,讨论aβ诱导星形胶质细胞功能损伤的分子机制,并进一步研究神经甾体孕酮对aβ所致星形胶质细胞功能损伤的神经保护性作用及其可能调控机制。第一部分aβ对星形胶质细胞的异常活化作用目的:研究aβ对原代培养皮层星形胶质细胞功能的影响,进而评价aβ对星形胶质细胞的异常活化作用。方法:取新生sd大鼠大脑皮层部位组织进行体外培养,分离纯化得到原代培养星形胶质细胞,immofluorescence方法检测星形胶质细胞标志蛋白gfap以鉴定其纯度。分别应用immofluorescence、westernblot、elisa方法检测aβ对星形胶质细胞形态,gfap蛋白表达,以及促炎症细胞因子il-1β、tnf-α分泌的影响。结果:1aβ促进星形胶质细胞促炎症细胞因子il-1β、tnf-α合成分泌应用aβ处理皮层星形胶质细胞不同时间(0h,3h,6h,12h,24h),elisa检测aβ干预下星形胶质细胞il-1β,tnf-α分泌水平变化。结果显示,aβ促进星形胶质细胞il-1β,tnf-α的合成分泌,与未干预组相比,aβ干预处理6h后il-1β,tnf-α分泌水平开始出现显著性提升。2aβ在星形胶质细胞内大量聚集应用aβ处理皮层星形胶质细胞不同时间(0h,3h,6h,12h),immofluorescence检测aβ在星形胶质细胞内的动态变化。结果显示,aβ干预星形胶质细胞3h后在细胞内出现aβ聚集,随着aβ干预时间的延长,aβ蛋白在细胞内的聚集程度持续增加,在细胞核附近和细胞浆中均有发现,延缓或阻断了星形胶质细胞自身的降解清除。3aβ诱导星形胶质细胞形态异常本部分通过荧光标记星形胶质细胞微管相关蛋白gfap,观察星形胶质细胞的形态改变。immofluorescence结果显示,与未干预组相比,aβ干预处理6h后星形胶质细胞出现了明显的形态改变,主要表现为细胞胞体膨胀,伪足收缩等。4aβ上调星形胶质细胞内gfap蛋白表达为进一步研究aβ对于星形胶质细胞的异常活化作用,我们检测与其活化相关的gfap蛋白表达的变化。westernblot检测结果显示,aβ诱导星形胶质细胞表达gfap蛋白,与未干预组相比,当aβ干预处理6h后,gfap蛋白表达出现了显著性的增加结论:aβ诱发星形胶质细胞异常活化,并导致促炎症细胞因子il-1β、tnf-α的大量合成分泌。第二部分aβ诱导星形胶质细胞炎症反应的机制研究目的:对aβ引起星形胶质细胞活化后炎症反应分子机制的探讨,并深入研究外源性炎症反应信号炎症小体nlrp3对于aβ所致神经炎症反应的调节作用。方法:新生sd大鼠,取大脑皮层部位组织进行体外培养,分离纯化得到原代培养星形胶质细胞,分别应用immofluorescence、westernblot方法检测aβ对星形胶质细胞炎症小体nlrp3表达,以及炎症信号调节蛋白caspase-1活化的影响。elisa方法检测nlrp3/caspase-1外源性炎症信号途径对aβ所致神经炎症反应的调节作用。结果:1aβ促进炎症小体nlrp3在星形胶质细胞内表达应用aβ处理皮层星形胶质细胞不同时间(0h,3h,6h,12h),immofluorescence和westernblot检测星形胶质细胞炎症小体nlrp3蛋白的表达。immofluorescence结果显示,随着aβ干预时间的延长,炎症小体nlrp3表达逐渐增加,当aβ干预6h时,星形胶质细胞内nlrp3表达活化出现显著的提升。westernblot结果显示,aβ干预6h后星形胶质细胞内炎症小体nlrp3表达相比对照组来说出现了显著性提高。2aβ促进炎症信号调节蛋白caspase-1在星形胶质细胞内的活化我们进一步考察,aβ对星形胶质细胞炎症反应调节蛋白caspase-1活化的影响。westernblot结果显示,aβ时间依赖型的促进caspase-1的成熟,主要表现为caspase-1p20片段表达的提升,aβ干预6h后caspase-1p20片段出现了显著性增加,相比对照组来说出现了显著性差异。当aβ干预时间到达12h后caspase-1进一步成熟(caspase-1p20表达提升),但是相比aβ干预6h后caspase-1p20表达量并无显著性差异。3nlrp3/caspase-1外源性炎症信号调节aβ所致的星形胶质细胞神经炎症反应我们进一步考察了,nlrp3/caspase-1外源性炎症信号对于aβ所致的星形胶质细胞神经炎症反应的调节影响。研究结果显示,aβ干预处理6h后il-1β,tnf-α分泌水平明显提升。与aβ干预组相比,caspase-1抑制剂z-yvad-fmk显著性的降低了aβ诱导下il-1β、tnf-α的合成分泌。结论:nlrp3/caspase-1外源性炎症信号的激活介导参与aβ所致星形胶质细胞的神经炎症反应。第三部分孕酮对aβ所致星形胶质细胞炎症反应的调节作用目的:研究神经甾体pg对于aβ所致星形胶质细胞神经炎症反应的神经调节作用,深入探讨孕酮可能的神经调节机制及相关炎症信号途径。方法:取新生sd大鼠大脑皮层原代培养星形胶质细胞,elisa方法检测pg对于aβ所致星形胶质细胞神经炎症反应的调节。应用westernblot方法检测pg对于aβ所致星形胶质细胞内炎症小体nlrp3表达,以及炎症信号调节蛋白caspase-1活化的影响。结果:1pg抑制aβ所致的星形胶质细胞il-1β、tnf-α的分泌不同浓度pg(0.25、0.5、1、2μm)与aβ共同处理6h,elisa检测在aβ干预条件下,不同浓度pg对于星形胶质细胞il-1β、tnf-α分泌水平的影响。结果显示,1μmpg能显著性的下调aβ所致星形胶质细胞il-1β、tnf-α的合成分泌。另外,应用elisa检测在aβ干预条件下,pg不同干预时间对于星形胶质细胞il-1β、tnf-α分泌水平的影响。研究结果显示,pg明显减弱aβ所致星形胶质细胞il-1β、tnf-α的分泌,与aβ处理组相比,1μmpg处理6h显著性的降低了aβ所致的星形胶质细胞il-1β、tnf-α的分泌。2pg调节星形胶质细胞aβ所致nlrp3的表达活化应用westernblot检测aβ干预条件下,pg对于星形胶质细胞炎症小体nlrp3表达活化的影响。结果显示,pg干预6h时,aβ所致的炎症小体nlrp3表达活化出现显著的下降,相比aβ干预组,炎症小体nlrp3表达出现了显著的差异。3pg调节星形胶质细胞aβ所致caspase-1的表达活化应用westernblot检测aβ干预条件下,pg对于星形胶质细胞caspase-1的剪切片段表达的影响(caspase-1p20)。结果显示,与aβ干预组caspase-1p20表达量相比,pg干预6h后显著性下调了aβ所致的caspase-1p20的表达活化。结论:神经甾体pg显著性的抑制aβ所致nlrp3炎症小体在星形胶质细胞内的表达,并通过下调caspase-1的活化抑制aβ所诱导的神经炎症反应。第四部分自噬对孕酮抑制aβ所致炎症反应的调节作用及机制研究目的:研究神经甾体pg对于星形胶质细胞自噬功能的影响,并进一步讨论自噬对于神经甾体pg抑制aβ所致神经炎症反应的可能调节机制。方法:取新生sd大鼠大脑皮层原代培养星形胶质细胞,elisa方法检测自噬对pg抑制aβ所致星形胶质细胞神经炎症反应的影响。应用westernblot方法检测pg对于aβ所致星形胶质细胞自噬功能的调节,并检测自噬对于炎症小体nlrp3及炎症信号调节蛋白caspase-1活化的影响。结果:1自噬介导pg对aβ所致星形胶质细胞il-1β、tnf-α分泌的影响为了深入研究自噬是否介导了pg对aβ诱导神经炎症反应的保护性机制。应用elisa检测自噬诱导剂rapamycin对aβ所致星形胶质细胞炎症反应的调节作用。结果显示,rapamycin显著性的降低了aβ诱导下il-1β、tnf-α的合成分泌。自噬抑制剂3-ma明显的抑制了pg对下il-1β和tnf-α合成分泌的调节作用,相比pg保护组,il-1β和tnf-α的合成分泌出现了显著性的升高。2pg促进aβ所致的星形胶质细胞自噬启动为深入探讨pg对于aβ干预下星形胶质细胞自噬功能的影响。westernblot结果显示,pg激活了星形胶质细胞自噬水平,相比aβ干预组,lc3-ii表达量出现了明显的提升,并促进了lc3-i到lc3-ii的转变。与此同时,pg干预后,beclin-1表达量也出现了显著性的提升。3pg促进aβ所致的星形胶质细胞自噬活化我们应用westernblot检测自噬降解底物调节蛋白p62表达量变化。研究结果显示,pg明显的提升了aβ干预下星形胶质细胞自噬功能,相比aβ干预组,p62蛋白显著性的降低。自噬抑制剂3-ma则阻断了pg对于星形胶质细胞自噬功能的活化作用,主要表现为lc3-ii表达的下降,lc3-i到lc3-ii的转化降低,以及p62蛋白表达翻转性的增加。4pg调节aβ诱导下星形胶质细胞akt/mtor信号为进一步研究pg对于自噬活化功能的影响,我们检测了星形胶质细胞内akt/mtor信号通路的表达变化。结果显示,pg显著性的抑制了aβ诱导条件下星形胶质细胞akt/mtor信号通路。5自噬介导pg调节星形胶质细胞aβ所致nlrp3的表达应用westernblot检测aβ干预条件下,自噬对于星形胶质细胞炎症小体nlrp3表达的调节作用。自噬诱导剂rapamycin,有效的促进了自噬对于aβ所致炎症小体nlrp3聚集的降解清除。自噬抑制剂3-ma显著性的阻断了pg对于炎症小体nlrp3的调节作用,与pg保护组相比,nlrp3蛋白显著性的增加。6自噬介导pg调节星形胶质细胞aβ所致caspase-1的活化为了进一步研究自噬对于炎症反应信号的调节作用,我们检测了炎症信号调节蛋白caspase-1的表达水平变化。研究结果显示,相比aβ干预组星形胶质细胞,自噬诱导剂rapamycin显著性的抑制aβ所致星形胶质细胞Caspase-1的活化,表现为Caspase-1 p20/pro-Caspase-1比例明显的降低。在PG保护干预下,Aβ引起的Caspase-1活化同样被显著性的抑制。但是自噬抑制剂3-MA则阻断了PG对于Aβ引起的Caspase-1活化的调节作用。结论:PG能够明显的提升Aβ诱导下星形胶质细胞自噬功能,加速了自噬对于自噬底物的处理清除,特别是对于炎症复合物小体NLRP3的清除作用,通过调节NLRP3/Caspase-1炎症反应信号,抑制Aβ所致的星形胶质细胞神经炎症反应。综上所述,本实验以Aβ干预原代培养皮层星形胶质细胞构建AD神经炎症细胞模型,研究神经甾体PG对Aβ所致星形胶质细胞神经炎症反应的保护性作用及其可能调控机制。研究发现,PG能够明显抑制Aβ所致的神经炎症反应,1μM PG处理6h显著性的降低了Aβ干预所致的星形胶质细胞炎症因子IL-1β、TNF-α的合成分泌。进一步研究发现,PG能够抑制Aβ引起的星形胶质细胞炎症小体NLRP3和炎症信号调节蛋白Caspase-1的表达活化,进而缓解Aβ引起的神经炎症反应,提示孕酮通过抑制外源性炎症信号NLRP3/Caspase-1调节Aβ引起的星形胶质细胞神经炎症反应;我们还发现PG能够上调Aβ所致星形胶质细胞自噬功能异常。PG通过活化星形胶质细胞自噬功能,调节NLRP3/Caspase-1炎症反应信号,进一步抑制Aβ所致的星形胶质细胞神经炎症反应。综上所述,神经甾体PG在Aβ所引起的神经炎症反应方面发挥着重要的调节作用,PG的这种神经保护性作用将为开发有效的AD防治策略提供了可参考的新型治疗方案。