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透明质酸(Hyaluronic acid)是一种具有生物相容性的高分子聚合物。由于特殊的生理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力,透明质酸在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域有广泛的应用。
目前,透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法。微生物发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向,因此开发先进的微生物发酵法生产HA的技术就显得十分必要。
本文对微生物发酵法生产透明质酸进行了的探索,主要完成了以下几个方面的工作,并得到了相关结论。
确定了摇瓶发酵培养基的适宜组成。通过500毫升摇瓶水平的单因素试验和多因素正交试验初步确定菌株发酵培养基的成分。即葡萄糖浓度40g/L、蛋白胨浓度10g/L、酵母粉浓度10g/L、K<,2>HPO<,4>浓度2 g/L、MgSO<,4>7H<,2>O浓度0.4g/L。
确定了菌株摇瓶发酵的适宜培养条件。绘制出种子培养基中菌体的生长曲线,取14h为接种的适宜种龄,发酵培养基中的适宜装液量确定为30ml/500 ml,产物HA积累的最适温度为34℃,最适初始PH值为7.4。
确定了小罐发酵适宜培养条件。在发酵罐水平上探索了适于产物代谢的适宜温度为34℃和PH值为7。摸索出适于产物积累的通氧和搅拌策略,即整个发酵过程采取较低的通氧速率5L/min,搅拌速率分两阶段调控,先采用低搅拌速率300r/min,待溶氧将下来以后,再采用高转速600r/min的调控方式,发酵效果较佳。在线控制发酵过程中的补料方式,摸索出了最适于产物积累的补料方式,在对数生长期进行葡萄糖的类指数补料的方式透明质酸的产量最高。
确定了透明质酸的分离提纯工艺。经过一系列提取纯化步骤:乙醇沉淀、沉淀物溶解、过滤、CPC络合、HA-CPC解离、成品沉淀、脱水、真空冷冻干燥等,得到成品。成品最终的各项指标接近于化妆品级的标准。整个提纯工艺的收率在75%左右。