炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)因致病因素复杂,且发病机制尚不清楚,其治疗手段目前十分有限。中药复方因其多成分、多靶点的特点,在某些难愈性疾病如炎症性肠病中有着独特的疗效,如黄芩汤在治疗IBD临床及实验研究中,均取得了比较理想的结果。但同样因中药成分尤其是汤剂的复杂性、作用靶点的不确定性等因素使得其作用机制难以阐明。近年来,肠道微生态与炎症性肠病之间的研究,为探究中药复方药效机制提供了方向。肠道黏膜上的肠道益生菌可通过“定植抗力”竞争性抑制致病菌,并产生细菌素、乳酸等代谢产物,降低致病菌的存活几率,形成“肠道微生物屏障”。这种屏障一旦破坏,可诱导或恶化肠道黏膜屏障损伤,导致有害菌进入肠腔。致病菌通过病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)引起肠黏膜免疫系统的过度活化,进而使机体产生病理性炎症和损伤,其中最典型的为IBD。故有学者形象地将IBD描述为“屏障器官性疾病”。PAMPs致病的具体作用环节,与宿主细胞的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)密切相关。在对PRRs的研究中,NOD2是第一个被发现与IBD直接相关的易感基因,其相应的配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)为细菌的细胞壁成分肽聚糖最简单的结构单位,在肠腔大量存在。MDP通过激活NOD2及其下游的信号蛋白,导致炎症因子释放以及细胞凋亡等,与IBD发病密切相关。根据文献研究,黄芩汤作为中医治疗IBD的经典方,在抗炎的同时也能影响肠道菌群,但其作用机制尚不清楚。因此,本研究以溃疡性结肠炎小鼠为动物模型,开展黄芩汤及其主要成分对IBD小鼠肠道菌群和MDP-NOD2炎性信号通路影响的研究,并提出如下科学假说:黄芩汤可以通过抑制细菌成分MDP所致的MDP-NOD2炎性信号通路以及恢复肠道微生物屏障,从而达到治疗IBD的目的。主要研究内容包括:黄芩汤质量控制、黄芩汤及其主要成分药效学考察(包括体、内外实验)、黄芩汤及其主要成分对MDP-NOD2炎性信号通路的影响(包括体、内外实验)、黄芩汤及其主要成分对肠道微生物屏障的影响,采用高效液相色谱法、16SrDNA基因组测序、免疫荧光、荧光定量RT-PCR、Western Blot、流式细胞术等现代生物学技术,探讨炎症性肠病常用方黄芩汤的药效机制。目的:菌群失衡导致黏膜屏障破坏,进而条件致病菌入侵黏膜下组织,经PAMPs与PRRs相互作用致炎及黏膜损伤,其中MDP-NOD2炎症信号通路对IBD的发病和转归有重要意义,黄芩汤作为治疗IBD的主要汤剂,很有可能通过该信号通路及菌群的恢复发挥其治疗作用。因此,本研究以溃疡性结肠炎小鼠为动物模型,开展黄芩汤及其主要成分对IBD小鼠MDP-NOD2炎性信号通路和肠道菌群影响的研究,旨在证明如下科学假说:黄芩汤可以通过抑制细菌成分MDP所致的MDP-NOD2炎性信号通路,同时恢复肠道微生物屏障功能,达到治疗IBD的目的。方法:1.黄芩汤的制备及质量分析运用高效液相色谱法对黄芩汤进行指纹图谱分析,并以黄芩苷、汉黄芩苷、芍药苷、甘草苷、甘草素为对照品分析黄芩汤主要成分。2 口服黄芩汤对DSS诱导UC小鼠的疾病状态的影响对经黄芩汤干预后的UC小鼠进行DAI评分、组织学评分、计数外周血白细胞,并采用ELISA方法检测血清以及结肠组织中细胞因子的含量,评价黄芩汤对DSS诱导UC小鼠的治疗作用。3黄芩汤对DSS诱导UC小鼠MDP-NOD2炎性信号通路的影响采sqPCR技术检测结肠组织中Nod2、Rip2、NFκB p65基因的表达情况,从基因水平判断黄芩汤对DSS诱导UC小鼠MDP-NOD2炎性信号通路的影响。采用Western Blot以及IF技术检测结肠组织中NOD2、RIP2、NFκB-p65蛋白的表达情况,从蛋白水平判断黄芩汤对DSS诱导UC小鼠MDP-NOD2炎性信号通路的影响。4.黄芩汤RAW264.7细胞MDP-NOD2信号通路的影响采用CBA分析方法检测黄芩汤冻干粉对MDP刺激后RAW264.7细胞上清中的细胞因子含量。采用PCR技术检测黄芩汤冻干粉对MDP刺激后RAW264.7细胞中Nod2、Rip2、NFκBp65基因的表达情况的影响,从基因水平判断黄芩汤对MDP-NOD2炎性信号通路的影响;采用Western Blot、IF技术检测黄芩汤对MDP刺激后RAW264.7细胞中NOD2、RIP2、NFκB-p65蛋白的表达情况的影响,从蛋白水平判断黄芩汤对MDP-NOD2炎性信号通路的影响。5.黄芩汤的主要作用成分研究—有效成分及剂量筛选通过检测黄芩汤主要成分对MDP所致RAW264.7细胞释放NO的影响,筛选出黄芩汤中的主要有效成分,MTT实验观察黄芩汤主要成分对RAW264.7细胞生长的影响,找出最适合的给药浓度。6.黄芩汤的主要作用成分研究—主要成分对UC小鼠的治疗作用对经黄芩汤主要作用成分干预后的UC小鼠进行DAI评分、组织学评分、计数外周血白细胞,并采用ELISA方法检测血清以及结肠组织中细胞因子的含量,评价黄零汤主要作用成分对DSS诱导UC小鼠的治疗作用。7.黄芩汤的主要作用成分研究—主要成分对UC小鼠MDP-NOD2通路的影响采用PCR技术检测结肠组织中Nod2、Rip2、NFκB p65基因的表达情况,从基因水平判断黄芩汤主要作用成分对DSS诱导UC小鼠MDP-NOD2炎性信号通路的影响。采用Western Blot以及IF技术检测结肠组织中NOD2、RIP2、NFκB-p65蛋白的表达情况,从蛋白水平判断黄芩汤主要作用成分对DSS诱导UC小鼠MDP-NOD2炎性信号通路的影响。8.黄芩汤的主要作用成分研究—主要成分对RAW264.7细胞MDP-NOD2通路的影响采用CBA法检测黄芩汤主要作用成分对MDP刺激后RAW264.7细胞上清中的细胞因子含量。采用PCR技术检测黄芩汤主要作用成分对MDP刺激后RAW264.7细胞中Nod2、Rip2、NFκB p65基因的表达情况,从基因水平判断黄芩汤主要作用成分对MDP-NOD2炎性信号通路的影响;采用Western Blot、IF技术检测黄芩汤主要作用成分对MDP刺激后RAW264.7细胞中NOD2、RIP2、NFκB-p65蛋白的表达情况,从蛋白水平判断黄芩汤主要作用成分对MDP-NOD2炎性信号通路的影响。9.黄芩汤及其主要成分对肠道菌群的调节作用小鼠自由饮用2.5%DSS 5天后,自由饮无菌水2天,复制小鼠IBD模型。无菌方法收集小鼠的粪便,提取粪便基因组DNA,采用16SrDNA基因组测序分析经黄芩汤干预后小鼠肠道菌群数量及组成变化。采用FCM检测肠上皮细胞表达抗菌蛋白的情况,以细菌通用引物为探针,采用细菌原位杂交检测试剂盒观察经黄芩汤干预后UC小鼠结直肠组织切片细菌侵袭的情况;采用MTT法检测黄芩汤对及其有效成分对标准菌株(脆弱拟杆菌等)以及肠道分离菌株的影响。结果:1.黄芩汤质量控制高效液相色谱法同时检测标准品与黄芩汤样品,经比对后发现黄芩汤中含有芍药苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄酸等指标性成分。其中,黄芩苷含量最高,其次是汉黄芩苷、甘草酸;根据指纹图谱分析结果,发现黄芩汤各批次之间生成的对照图谱中除了两个样品相似度为0.958和0.966外,其余样品相似度均在0.980以上。2.口服黄芩汤对DSS诱导UC小鼠的疾病状态的影响给予DSS后,小鼠体重明显下降,出现腹泻、便血等症状;结肠明显缩短,官腔狭窄,组织水肿、增厚,有明显炎性细胞浸润,上皮细胞脱落,形成多个溃疡;WBC、Mon、Gran明显增多,而RBC、HGB明显减少;结肠组织中的炎性细胞因子,与正常组比较明显升高(P<0.01);给予柳氮磺吡啶后,以上指标均有不同程度恢复;给予不同剂量的黄芩汤后,小鼠体重恢复明显,疾病活动指数明显降低(P<0.01);结肠长度均明显恢复(P<0.01),结肠组织学评分均降低(P<0.05或P<0.01),呈剂量依耐性;组织学评分与模型组相比有统计学意义(P<0.01或P<0.05);组织匀浆细胞因子均有不同程度恢复,其中黄芩汤中剂量以及高剂量组恢复明显,与模型组相比有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。3.黄芩汤对DSS诱导UC小鼠MDP-NOD2炎性信号通路的影响SqReal-Time PCR实验发现,给予DSS后,模型组小鼠结肠组织中的Nod2、Rip2、NFκB p65基因表达明显上调,与正常组相比,差异有统计意义(P<0.01);给予柳氮磺吡啶后,与模型组相比,Nod2、Rip2、NFκBp65基因表达明显下调(P<0.01);给予不同剂量的黄芩汤后,Nod2、Rip2、NFκB p65基因均有不同程度恢复,除黄芩汤低剂量对Rip2基因表达调节没有统计学意义外,其余组别对三个基因的调节与模型组相比均有统计学意义(P<0.01或P<0.05);Western blot实验结果表明,给予DSS后,模型组小鼠结肠组织中的NOD2、RIP2、NF-KB p65蛋白表达明显上调,与正常组相比,差异有统计意义(P<0.01);给予柳氮磺吡啶后,与模型组相比,NOD2、RIP2、NF-KB p65蛋白表达明显下调(P<0.01);给予黄芩汤后,NOD2、RIP2、NF-κB p65蛋白均有不同程度恢复,与模型组相比,黄芩汤对三个蛋白的调节均有统计学意义(P<0.01)。4.黄芩汤RAW264.7细胞MDP-NOD2信号通路的影响细胞实验结果表明,给予MDP后,RAW264.7细胞上清中的髓过氧化物酶以及炎性细胞因子明显升高,与正常对照相比有统计学意义(P<0.01或P<0.05);给予不同剂量的黄芩汤后,髓过氧化物酶以及炎性细胞因子明显降低,髓过氧化物酶以及IL-17、MCP-1、TNF-α、IFN-γ 含量明显降低,其中黄芩汤 250μg/mL、125μg/mL 与MDP模型对照相比有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。PCR实验结果发现,给予MDP后,RAW264.7细胞的Nod2、Rip2、NFκB-p65基因表达明显上调,与正常对照相比,差异有统计意义(P<0.01);给予不同剂量的黄芩汤后,Nod2、Rip2、NFκB-p65基因均有不同程度恢复,其中250μg/mL黄芩汤对三个基因均下调明显,125μg/mL黄芩汤对Nod2、Rip2基因表达有明显下调作用(P<0.01或P<0.05);Western blot实验结果发现,给予MDP后,RAW264.7细胞的NOD2、RIP2、NF-κB p65蛋白表达明显上调,与正常组相比,差异有统计意义(P<0.01);给予黄芩汤后,NOD2、RIP2、NF-κB-p65蛋白均有不同程度恢复,与模型组相比,黄芩汤对三个蛋白的调节均有统计学意义(P<0.01)5.黄芩汤的主要作用成分研究—主要成分对UC小鼠的治疗作用通过检测黄芩汤不同成分对MDP所致RAW264.7细胞产生NO的影响可知,当黄芩苷的浓度为12.5～800μg/mL时,可明显抑制MDP所致RAW264.7细胞产生NO(P<0.01);当芍药苷的浓度为12～768μg/mL时,可明显抑制MDP所致RAW264.7细胞产生NO(P<0.01或P<0.05),以上浓度范围均对RAW264.7细胞的长无影响。6.黄芩汤的主要作用成分研究—主要成分对UC小鼠的治疗作用根据药效学研究实验发现,黄芩苷和芍药苷能改善DSS诱导的UC小鼠体重下降,腹泻、便血、结肠缩短,管腔狭窄,组织水肿、增厚,炎性细胞浸润,上皮细胞脱落,溃疡形成等症状,还能降低外周血白细胞数量,以及结肠组织中的炎性细胞因子释放。给予芍药苷后,结肠长度恢复明显,不同剂量组与模型组相比均有统计学意义(P<0.01或P<0.05),黄芩苷中剂量以及高剂量组与模型组相比均有统计学意义(P<0.01);给予黄芩苷后,中剂量以及高剂量组小鼠结肠组织学评分均降低(P<0.01),给予芍药苷后,不同剂量组小鼠结肠组织学评分均降低(P<0.05或P<0.01),呈剂量依耐性;除HGB外,黄芩苷和芍药苷中剂量以及高剂量组对外周血白细胞恢复均明显,与模型组相比有统计学意义(P<0.01或P<0.05),而仅黄芩苷和芍药苷高剂量对HGB有明显恢复作用(P<0.05);黄芩苷和芍药苷中剂量以及高剂量组结肠组织炎症因子恢复均明显,与模型组相比有统计学意义(P<0.01或P<0.05),而低剂量只对IFN-γ有明显降低作用(P<0.05)。7.黄芩汤主要成分对UC小鼠MDP-NOD2通路的影响UC小鼠的治疗作用SqReal-Time PCR实验发现,黄芩苷和芍药苷能下调DSS诱导的UC小鼠结肠组织中Nod2、Rip2、NFκBp65基因表达,其中黄芩苷中剂量以及高剂量组Nod2、Rip2基因下调明显,与模型组相比有统计学意义(P<0.01或P<0.05),黄芩苷高中低剂量均可下调NF-κB p65基因表达(P<0.01);除Rip2基因,芍药苷高、中、低剂量均可下调Nod2、NFκB p65基因表达(P<0.01),对Rip2基因表达调节较明显的为中剂量以及高剂量组,与模型组相比均有统计学意义(P<0.01);通过Western blot实验发现,黄芩苷和芍药苷能恢复DSS诱导的UC小鼠结肠组织中NOD2、RIP2、NF-κB p65蛋白水平,与模型组相比均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。8.黄芩汤主要作用成分对RAW264.7细胞MDP-NOD2通路的影响黄芩苷能明显降低MDP所致RAW264.7细胞上清中的MPO水平,实验3个剂量组与模型组相比均有统计学意义(P<0.01或P<0.05),而芍药苷在浓度为96、48μg/mL时与MDP组相比有统计学意义(P<0.01或P<0.05);黄芩苷50μg/mL、25μg/mL可明显抑制IL-17、MCP-1、TNF-α、IFN-y释放,与MDP模型对照相比有统计学意义(P<0.01或P<0.05),而低剂量12.5μg/mL只对MCP-1有作用(P<0.05);不同剂量的芍药苷对MCP-1均有作用,与MDP模型对照相比有统计学意义(P<0.01或P<0.05);芍药苷对IL-17、TNF-α的作用只在浓度为96、48μg/mL时才体现(P<0.01或P<0.05 vs MDP);芍药苷对IFN-y的作用只在高浓度时体现(P<0.05)。50μg/mL黄芩苷能抑制MDP引起RAW264.7细胞Nod2、Rip2、NFκB p65基因高表达,25μg/mL黄芩苷仅对Rip2基因表达有明显下调作用(P<0.01或P<0.05);96pg/mL芍药苷能抑制MDP引起RAW264.7细胞Nod2、Rip2、NFκB p65基因高表达,48μg/mL芍药苷仅对Rip2基因表达有明显下调作用(P<0.01或P<0.05)。黄芩苷能抑制MDP引起RAW264.7细胞NOD2、RIP2、NF-κB p65蛋白高表达,与模型组相比均有统计学意义(P<0.01或P<0.05);给予芍药苷后,NOD2、RIP2、NF-κB p65蛋白均表达下调,与模型组均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。9.黄芩汤及其主要成分对肠道菌群的调节作用①从物种丰富程度来看,UC小鼠肠道菌群的OUT数减少,丰富程度降低,黄零汤可改善这一状况。②从样品间物种组成聚类分析结果来看,UC小鼠肠道菌群组成与正常小鼠差异明显,经黄芩汤治疗后小鼠肠道菌群与正常小鼠最接近,其次为柳氮磺吡啶与芍药苷、最后为黄芩苷。③从样品多样性分析结果来看,UC小鼠肠道菌群的多样性明显减少,给予药物治疗后,菌群的多样性有一定恢复,其中黄芩汤的疗效有显著意义。④肠道菌群的相对丰度分析:从门水平分析,UC小鼠拟杆菌门减少,脱铁杆菌门、厚壁菌门明显增多;给予药物治疗后,以上菌群均有不同程度恢复,其中拟杆菌门因个体差异较大并无显著性,柳氮磺吡啶以及黄芩汤对脱铁杆菌门恢复明显;从种水平分析,给予 DSS 后,模型组 caccae、Escherichia_coli 细菌相对丰度明显增多,而 Lactobacillus reuteri、Butyricicoccus_pullicaecorum、Clostridium_perfringens、Desulfovibrio_C21 c20、Unclassified明显减少,与正常组相比有统计学意义(P<0.01或P<0.05);给予药物治疗后,柳氮磺吡啶、黄芩苷均具有恢复Unclassified、Muispiillum rschaedleri细菌的作用,与模型组相比均有统计学意义(P<0.01或P<0.05);实验中所用药物均具有抑制Bacteroies cacacde的作用(P<0.01);给予黄芩汤后,Lactobacillus reuteri、Butyricicoccus_pullicaecorum、Unclassified Mucispirillum Schaedleri、Escherichia coli明显减少,以上差异与模型组相比均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。⑤由于DSS所致上皮屏障破坏,肠腔内容物及细菌等直接接触肠上皮细胞,刺激RegⅢγ表达上调(P<0.01),给予柳氮磺吡啶、黄芩苷、芍药苷以及黄芩汤治疗后,上皮修复及菌群被抑制,使肠上皮细胞表达RegⅢγ减少,以上差异与模型组相比均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。⑥正常小鼠上皮完整,黏膜下只有个别细菌存在;给予DSS后,小鼠结肠上皮缺失、脱落,黏膜下浸润了大量细菌;给予柳氮磺吡啶、黄芩苷、芍药苷以及黄芩汤治疗后,小鼠肠上皮趋于恢复,肠黏膜下细菌明显减少,以上结果在黄芩汤给药组中最为突出。⑦黄芩汤对细菌的生长具有选择性作用,表现为对丁酸梭菌、两歧双歧杆菌、乳酸杆菌有促增殖作用,而对脆弱拟杆菌、大肠杆菌有抑制作用;黄芩苷仅对乳酸杆菌有促进作用,对脆弱拟杆菌有抑制作用,而对其他细菌作用均不明显;芍药苷对实验中的细菌主要表现为抑制作用,尤其在高浓度时更突出。结论:1.黄芩汤能改善DSS诱导的UC小鼠疾病状态,其机制可能与黄芩汤抑制MDP-NOD2炎性信号通路有关。2.黄芩汤中通过抑制MDP-NOD2炎性信号通路改善DSS诱导的UC小鼠疾病状态的主要成分为黄芩苷和芍药苷。3.黄芩汤能调节UC小鼠肠道菌群比例及其数量,恢复微生物屏障功能,减少炎症局部细菌浸润,该作用优于其他单一成分。