HIV感染者梅毒筛查流程及梅毒螺旋体膜蛋白Tp47对HIV经生殖道感染影响的研究

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近年来梅毒发病率有明显上升趋势,在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者中,情况尤为严重。目前国际上存在三种梅毒筛查流程,包括传统、反向及欧洲疾病预防控制中心(ECDC)筛查流程,哪种方法更适合在HIV感染者中筛查梅毒并不明确。流行病学研究表明梅毒感染能增加对HIV的易感性,但是关于梅毒对HIV在生殖道黏膜处传播影响的研究却非常有限。因此,我们进行了以下研究:第一部分,为评价不同的梅毒筛查流程对HIV感染者梅毒血清检测阳性率的影响,我们根据样本量计算公式N=Zα2P(1-P)/δ2,结合HIV感染患者梅毒大致流行率及3%误差和95%的置信区间,估算一共至少需要677份样本。我们共收集了 865例HIV感染者血清,对每个样本同时进行梅毒甲苯胺红加热血清诊断试验(TRUST)、梅毒螺旋体血凝试验(TPPA)和酶联免疫法检测梅毒螺旋体抗体试验(TP-ELISA),按照三种不同的筛查流程分别计算梅毒血清检测阳性率,将结果进行McNemar’s检验分析。结果表明,865例样本中,反向筛查流程的梅毒血清检测阳性率为24.9%,传统筛查流程的阳性检出率为14.2%,两者之间差异有统计学意义(P<0.0001);反向筛查流程与ECDC筛查流程的总符合率为99.8%。第二部分,目前梅毒检测过程中,存在血清固定、在感染初期尚未出现抗体导致假阴性等问题。为了建立一种用于检测梅毒抗原的方法以早期、便捷辅助诊断梅毒,本研究制备了抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47单克隆抗体。首先利用基因重组技术表达、纯化TP47蛋白,将其免疫BALA/c小鼠,采用杂交瘤融合技术获得了5株抗Tp47蛋白的单抗。1E2B4株为IgG2a型,其余四株均为IgGI型,其中1E2B4株抗体效价最高,经ELISA测定达1:4x105。经Western Blot、免疫共沉淀实验鉴定,5株抗体对靶抗原识别具有良好的特异性。利用1B3F2株和1E2B4株初步建立了 ELISA、胶体金试纸条的方法检测重组Tp47蛋白,其中ELISA的灵敏度为6ng/ml,特异性好,具有潜在的临床应用价值。第三部分,为了探索梅毒螺旋体感染对HIV经生殖道感染的影响及相关机制,我们利用梅毒螺旋体主要的膜蛋白Tp47刺激宫颈内膜细胞End1/E6E7来模拟梅毒螺旋体对HIV在生殖道黏膜传播的影响。经Tp47蛋白刺激后,End1/E6E7细胞在蛋白、mRNA水平上均有IL-6、IL-8表达升高(p<0.05),同时增加了 HIV感染后细胞内病毒抗原水平(p<0.05)。HIV感染经Tp47预处理的End1/E6E7与单纯感染病毒组相比,mRNA二代测序筛选出其上调的差异基因涉及的生物学过程主要富集在“调节细胞因子合成”、“调节与免疫相关的细胞因子”、“细胞运动”、“蛋白进入”相关,经定量PCR验证,转录组测序结果可信度高。综上所述,本研究得到以下结论:(1)在HIV感染者中建议采用反向或者ECDC筛查流程来筛查梅毒,传统筛查流程可能严重低估HIV感染者的梅毒血清检测阳性率。(2)本研究制备的抗Tp47单克隆抗体能敏感且特异地识别Tp47蛋白,利用自主研发的抗Tp47单抗,初步建立了 ELISA、胶体金试纸条检测重组TP47蛋白,在梅毒抗原诊断方面具有潜在的应用前景。(3)梅毒螺旋体膜蛋白Tp47可能通过促进炎症因子的表达来增强HIV经生殖道传播。
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