论文部分内容阅读
目的：(1)构建包含猪带绦虫六钩蚴期和囊尾蚴期特异性疫苗候选分子的囊尾蚴病多期复合基因疫苗。(2)评价该复合基因疫苗的免疫效应。方法：(1)分别提取猪带绦虫六钩蚴和囊尾蚴总RNA，应用RT-PCR方法分别扩增六钩蚴期特异性抗原TSOL18和囊尾蚴期特异性抗原cC1编码基因，另外设计引物应用重叠延伸PCR技术通过一柔性接头（linker）(Gly4Ser)3串联这两个基因，使TSOL18基因在前，cC1基因在后，即融合基因TSOL18+linker+cC1（简写为TSOL18/L/cC1）。将TSOL18/L/cC1融合基因装载至pMD18-T载体中，并测序验证。提取pMD18-TSOL18/L/cC1质粒DNA，经Xho I和Nhe I双酶切，纯化后的酶切产物TSOL18/L/cC1基因通过T4连接酶与经Xho I和Nhe I双酶切并纯化的pVAX1真核表达质粒连接，构建pVAX1-TSOL18/L/cC1重组质粒，同时构建pVAX1-TSOL18, pVAX1-cC1。将所构建的重组质粒通过阳离子聚合物介导转染293T细胞，设转染pVAX1空载体组和未转染组转染；转染72h后分别收集细胞，提取转染后的细胞总RNA，通过RT-PCR、间接免疫荧光、Western-blot鉴定融合基因在真核细胞中的表达状态；以构建的重组质粒肌肉注射小鼠，以免疫组化检测融合基因在小鼠骨骼肌的真核表达效果。（2）以pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1、pVAX1-TSOL18/L/cC1经肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠，以流式细胞术检测免疫后小鼠脾淋巴细胞胞内细胞因子等细胞免疫指标，并以间接ELISA法检测相应的特异性抗体及特异性抗体动态变化等体液免疫指标。结果：(1)构建的pVAX1-TSOL18/L/cC1重组质粒经酶切电泳和测序结果与预期设计的基因序列一致。真核细胞转染后通过RT-PCR检测显示除转染pVAX1空载体组和未转染组外，其余各组均有相应mRNA的表达。真核细胞转染后通过间接免疫荧光、Western-blot检测表明能够在293T细胞中表达出目的蛋白。免疫组化染色后在重组质粒注射部位肌肉组织的肌纤维内显示棕黄色阳性分泌颗粒，并且pVAX1-TSOL18/L/cC1组比pVAX1-TSOL18组棕黄色阳性分泌颗粒多，空载体组与空白对照组骨骼肌组织未见明显的棕黄色颗粒。（2）pVAX1-TSOL18/L/cC1组小鼠血清IgG抗体均显著高于pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1组及PBS组和pVAX1组(P<0.05)。 pVAX1-TSOL18/L/cC1组、pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1组分泌IFN-γ的CD4~+T及CD8~+T细胞各亚群比例均显著高于PBS组和pVAX1组(P<0.05)， pVAX1-TSOL18/L/cC1组又显著高于pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1组(P<0.05)；pVAX1-TSOL18/L/cC1组、pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1组分泌IL-4的CD4~+T细胞亚群比例显著高于PBS组和pVAX1组(P<0.05)，而pVAX1-TSOL18/L/cC1组、pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1组与PBS组和pVAX1组组间无显著差异（P＞0.05）；pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1组分泌IL-4的CD8~+T细胞亚群比例显著高于PBS组和pVAX1组(P<0.05)，而pVAX1-TSOL18/L/cC1组与与PBS组和pVAX1组组间无显著差异（P＞0.05）。结论：（1）成功构建包含猪带绦虫六钩蚴和囊尾蚴期特异性疫苗候选分子的囊尾蚴病多期复合基因疫苗pVAX1-TSOL18/L/cC1。并且初步揭示了其在体内和体外的表达。（2）囊尾蚴病多期复合基因疫苗pVAX1-TSOL18/L/cC1较单基因疫苗pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1诱导更为全面的免疫应答效应。