基因治疗被认为是很有前景的攻克肿瘤的新手段,包括修复抑癌基因缺陷,失活致癌基因,免疫基因治疗和病毒基因治疗等。基因治疗系统中基因转导载体是治疗成功与否及治疗效率如何的关键因素。病毒载体介导的基因转移方法在目前的基因治疗中占有重要地位,其中腺病毒载体系统是把基因转入到哺乳动物细胞中的一种常用的方法。腺病毒载体是一种线状双链DNA　病毒,有许多优点:①有广宿主性,尤其是能有效地感染非分裂状态的细胞;②安全性好,用于基因治疗的腺病毒完全无毒、无致病性;它们很少插入到宿主的染色体中,病毒DNA　一般存在于细胞染色体外,整合突变致癌及遗传病的可能性较小;③理化性质较稳定,经得起纯化,浓缩;容易提纯到很高滴度的腺病毒;　④腺病毒表达效价高,　外源基因的容纳量大,最高可达36　kb。因此,腺病毒载体系统是目前基因治疗中运用最广的病毒载体之一。　肿瘤的发生与发展与机体的免疫力低下密切相关,免疫治疗是目前恶性肿瘤治疗的有效策略之一,其中IL-12的免疫治疗研究显示了其具有强大的抗肿瘤活性,可使肿瘤明显消退,转移率和复发率降低,还可拮抗肿瘤新生血管,但由于其全身使用时的明显副作用而无法推广使用。于是人们采用了基因-免疫治疗,通过带有IL-12载体的基因治疗可在肿瘤局部产生高浓度且持久的作用,减少了全身不良反应,并在动物模型上取得了良好的效果。　然而,IL-12与许多基因一样,如果使之无调控的持续过度表达,不仅对疾病的治疗不利,甚至会产生致命的副作用。实现对目的基因进行有效调控,使其安全有效地表达,一直是基因治疗的难点和热点问题。对目的基因的表达时间和表达水平的精确调控,不仅能提高基因治疗的安全性,而且能使基因表达控制在有效作用浓度范围内,从而避免较大的全身毒性。目前通过诱导调控系统来实现基因的精确表达是最常用的方法,在已构建成的多种诱导调控系统中,RU486诱导调控系统由于具有本底表达低,诱导效率高,免疫原性小,诱导剂无毒性等优点,应用日益广泛。　胃癌发病率在世界常见恶性肿瘤中占第4位,死亡率占恶性肿瘤第2位,而我国情况尤其严重,胃癌是中国的第三大常见肿瘤,每年新发胃癌患者达40万人,死亡人数达30万人,死亡人数在所有癌症中居首位,患病率和死亡率超过世界平均水平的两倍,而且胃癌死亡总数仍呈上升趋势。胃癌由于其起病隐匿,发现时往往已届中晚期,手术、放疗、化疗难以达到满意疗效。由于缺乏有效的治疗手段,胃癌的死亡率始终居高不下。因此,人们在期待着晚期胃癌的治疗获得新的突破。　本研究利用RU486诱导调控系统,在mIL-12基因的上游建立了一个基因开关,构建成携带mIL-12基因的可调控重组腺病毒载体,通过小分子药物RU486诱导来实现mIL-12基因的调控表达,有效控制mIL-12的表达水平,从而使胃癌的基因免疫治疗更加安全可靠。　第一部分　　携带mIL-12基因的可调控重组腺病毒载体的构建、鉴定及制备　（1）通过分子生物学技术,改造了含有GLP65反式作用调控因子和GAL4杂合启动子的PRS17质粒。先予PCR扩增BGHpolyA片段,并引入需要的酶切位点,在GLP65调控区上游加入了hCMV启动子,在杂合启动子下游加入了mIL-12。同时,为减少两个转录单元之间的潜在干扰,加入了1.2kb的小鸡β珠蛋白绝缘子。最后将整个调控表达框装入PDC313载体中,成功的构建了PDC-RUmIL-12穿梭载体,经过酶切分析、PCR和测序鉴定均证实了其正确性。　（2）利用AdMAX腺病毒重组系统,将穿梭载体PDC-RUmIL-12与以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒骨架载体pBHGloxΔE1,E3cre,通过Polyfect　Transfection　Reagent试剂共转染至293细胞,通过Cre/loxP重组酶介导下的位点特异性重组,使共转染到293细胞中的穿梭载体和骨架载体在重组酶的作用下产生重组腺病毒,得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺型腺病毒,重组腺病毒载体命名为Ad-RUmIL-12,PCR扩增证实其正确后,予大量扩增和纯化,滴度达到4.62×10¹⁰　pfu/ml。　（3）采用与构建mIL-12相同的技术路线,构建带有报告基因的可调控重组腺病毒载体Ad-RULUC和Ad-RURED,为检测RU486调控系统的调控效果提供了良好的工具。　第二部分　　携带mIL-12基因的可调控重组腺病毒载体的体外实验研究　（1）穿梭载体PDC-RULUC在胃癌细胞株中的调控表达:将萤火虫荧光素酶质粒和海肾荧光素酶质粒用阳离子聚合物Polyfect　Transfection　Reagent（Qiagen）共转染细胞,用量分别为2ug和0.1ug,即比例均为20:1。设阳性对照组:pGL3-Control和pRL-TK,阴性对照组:pGL3-Basic和pRL-TK,七个实验组:PRS-RULUC和pRL-TK。细胞培养24小时后,七个实验组内加入一定量的RU486,使培养液的药物浓度分别达到0、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、　1×10^-8、1×10^-9、1×10^-10mol/L,继续孵育48小时。每孔中的附着细胞用双荧光素酶报告基因检测,结果表明没有加入诱导剂RU486时,质粒PDC-RULUC有少量的本底表达。当RU486浓度达到1×10^-10　mol/L时,即可诱导载体表达萤火虫荧光素酶,并且萤火虫荧光素酶的相对活性（F/R）随诱导剂的浓度增加而升高,存在明显的剂量反应关系,当RU486浓度达到1×10^-6　mol/L时,载体的表达效能达到最大,萤火虫荧光素酶的相对活性是其基础表达的40倍,此时继续增加RU486浓度至1×10^-5　mol/L,而F/R值不再升高。经方差分析显示未加入RU486时,本底表达与阴性对照组无显著差异（P>0.05）,经RU486诱导后荧光素酶基因的表达与阴性对照组的差异具有显著性（P<0.05）　（2）Ad-RURED可调控重组腺病毒载体在胃癌细胞株中的表达:用携带DsRed报告基因可调控重组腺病毒以MOI=100感染胃癌细胞株,予不同浓度的RU486诱导表达,培养液的药物浓度分别达到0、1×10^-6、1×10^-7、　1×10^-8、1×10^-9、1×10^-10（mol/L）,继续孵育48小时。在没有加入诱导剂RU486时,倒置荧光显微镜下可见很少量的细胞表达红色荧光蛋白,并且亮度较低。加入诱导剂RU486后,培养液中的RU486为1×10^-10　mol/L浓度时,即可诱导载体表达红色荧光蛋白,镜下可见表达红色荧光蛋白的细胞增多,同时亮度增加,随着RU486浓度的增加,表达红色荧光蛋白的细胞数量和亮度均相应增加,存在明显的剂量反应关系。　（3）Ad-RUmIL-12可调控重组腺病毒在胃癌细胞株中的表达:以MOI=100分别加入Ad-RUmIL-12于鼠MFC胃癌细胞中,各孔中加入诱导剂RU486,使培养液上清达到不同浓度:　0、1×10^-10、1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6（mol/L）,CO2孵箱继续孵育;收集病毒感染并诱导48小时的胃癌细胞培养上清液,-80℃冻存;更换5%血清培养液,去除诱导剂RU486,CO2孵箱48h,收集培养上清液,-80℃冻存;用BD公司的Mouse　IL-12　（p70）　ELISA　Set　试剂盒检测不同时间的上清液中mIL-12　p70的浓度,检测按试剂盒说明书操作;根据所测得的标准品的吸光值绘制对数曲线,建立蛋白ELISA检测mIL-12标准曲线的直线回归方程,通过回归方程计算出各样品的蛋白浓度。结果显示:在加入诱导剂RU486后48小时,测得各浓度组mIL-12的表达量与诱导剂的浓度呈正相关,去除诱导剂后48小时再次检测,则各组的只有少量的mIL-12表达量,表明Ad-RUmIL-12重组腺病毒载体可经RU486诱导表达,而在无诱导剂时Ad-RUmIL-12重组腺病毒载体在胃癌细胞株中的表达停止。　第三部分　　携带mIL-12基因的可调控重组腺病毒载体治疗胃癌的体内实验　（1）挑选48只皮下肿瘤生长至6-7mm的MFC移植瘤小鼠进行治疗,随机分为PBS、Ad-RUmIL-12　　Ad-RUmIL-12+　RU486　和Ad-RUmIL-12四组,每组12只。给药途径为直接瘤内多点注射。每天注射一次,共五次,每次注射病毒悬液100μl,病毒滴度为3×10¹⁰　pfu/ml,总剂量为1.5×10¹⁰　pfu,每周测量肿瘤体积大小,取最大径（a）和最小径（b）,计算肿瘤体积=（2）肿瘤凋亡检测:治疗后14天,各组取2只模型鼠脱颈处死,取下肿瘤块,肿瘤块分别用10%甲醛固定,行常规病理检查。另外,　取部分肿瘤组织,经剪成小块,过不锈钢网,制备成单细胞悬液。用Annexin　V-FITC　细胞凋亡检测试剂盒染色后,一小时内完成流式细胞仪分析。PBS和Ad-RUmIL-12治疗组在散点图只可见极少量的凋亡细胞,而Ad-RUmIL-12+　RU486　和Ad-mIL-12治疗组则可见凋亡细胞明显增多。　（3）血清　mIL-12检测:小鼠于开始治疗的第0、7、14和21天,每组取3只动物眼球后抽静脉血0.1ml,　4000rpm,离心15min,取血清,-80℃冻存,用ELISA检测mIL-12浓度。结果示:第7天时,PBS组基本测不到的mIL-12,Ad-RUmIL-12组的血mIL-12保持在很低的水平,而Ad-RUmIL-12+　RU486　和Ad-mIL-12治疗组,可以测到mIL-12的明显增加,与PBS和Ad-RUmIL-12组之间有明显的差异,Ad-RUmIL-12+　RU486组停用RU486后,血中的mIL-12迅速下降,第14天测得值与Ad-mIL-12治疗组之间有明显的差异。由此可以得出,Ad-RUmIL-12在活体内,同样可被诱导剂RU486良好的诱导调控,显示了良好的安全性。　结论　（1）构建了PDC-RUmIL-12穿梭载体,并利用AdMAX腺病毒系统,成功地构建携带mIL-12基因的可调控重组腺病毒载体Ad-RUmIL-12,PCR鉴定正确后,大量扩增和纯化,腺病毒滴定达到4.62×1010　pfu/ml,表明构建带RU486诱导调控系统的腺病毒载体是可行的。　（2）在体外和体内实验结果提示,可调控腺病毒载体均可在诱导剂RU486诱导下,有效表达目的基因,并与诱导剂的剂量呈正相关,停用诱导剂后目的基因表达停止,证实了RU486调控系统具有特异性高,背景表达低,不易受其它因素干扰,诱导效率高,诱导剂无毒性等诸多优点。　（3）在小鼠移植动物模型上,腺病毒载体可表达mIL-12,并发挥免疫调节作用,使荷瘤小鼠的抗原提呈能力增强,明显激活机体的抗肿瘤免疫,使抗肿瘤能力增强,有效抑制种植瘤生长。大部分小鼠移植瘤减少,生存期延长。表明携带mIL-12基因的可调控重组腺病毒载体Ad-RUmIL-12可在活体内由RU486有效调控表达。