论文部分内容阅读
苎麻花叶病是苎麻生产上的严重病害,其病原是苎麻花叶病毒。目前国内的研究多集中在苎麻花叶病毒的生物学特性上,对于其分类地位以及基因组结构方面的研究未见报道。根据苎麻花叶病毒的生物学特性我们初步把它归为长线形病毒科成员,该科病毒成员间亲缘关系较复杂,具所有正义ssRNA植物病毒中最长的基因组。我们在提纯苎麻花叶病毒的基础上构建了该病毒的cDNA文库,为后续的研究打下基础,以期对该病毒进行更深入的研究。本实验取自湖南农业大学苎麻研究所种质圃具有苎麻花叶病典型症状的苎麻叶片,通过超速离心和密度梯度离心结合的方法进行苎麻花叶病毒的提纯,病毒提取液经负染后电镜观察,观察到线状病毒粒子,大小为(1265±20nm)×(13±1nm);并对病毒提取液进行SDS-PAGE电泳分析,在胶上有一相对分子量为25kDa的单一蛋白条带,推测其为苎麻花叶病毒的外壳蛋白;对病毒的精提纯液用蛋白酶K消化法提取RNA,电泳检测到一约15000bp的单链核酸。为进一步研究病毒的基因组结构,我们随机引物起始,以AMV Reverse Transcriptase合成cDNA的第一链;然后用RNase H消化,DNA Polymerase I合成第二链;T4 DNA Polymerase补平粘性末端;通过Taq DNA Polymerase的活性给平末端加上A尾,用Promega公司的Resin and Spin Columns试剂盒去除多余的dATP和小片段cDNA后连接PMD-19T载体,构建了苎麻花叶病毒的cDNA文库。合成的双链cDNA经电泳检测其大小分布均匀;通过随机挑选克隆进行酶切和PCR检测,结果表明插入片段的大小为1000bp左右;统计蓝白斑的比例我们计算出文库的重组率为96%;说明我们构建的文库质量较好,能满足我们后续研究的需要。我们随机挑选克隆进行测序,通过对序列B09和G06的比对分析,我们发现该病毒和长线形病毒科长线形病毒属的葡萄卷叶伴随病毒2号(GLRaV-2)同源性最高。通过和长线形病毒科的三个属中已知的病毒序列的分析比较,我们初步判断苎麻花叶病毒与长线形病毒属亲源关系较近,和Ampelo病毒属、毛形病毒属的亲源关系较远;但要得到关于其分类地位的直接证据还有待于进一步的实验验证。