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双微体(double minute chromosomes,DMs)是基因扩增的主要细胞遗传学标志,是染色体外遗传单位存在的一种主要形式。研究表明,双微体与肿瘤发生、演进及耐药过程密切相关。
目的:前期研究发现人卵巢癌细胞系UACC-1598中双微体起源于人类染色体2p24的280kb的DNA序列,该序列是以MYCN为核心的扩增子,此外还有270kb是非编码序列,该研究的目的就是探讨双微体2号扩增子上非编码序列的组成以及它们在双微体功能调节中的作用,从而进一步阐明双微体的功能。
方法:本研究通过MARFinder(www.futuresoft.org/MAR-Finder/)生物信息学软件对280kb的DNA序列进行分析并对核基质结合序列(matrix attachedregion,MAR)进行预测。分别采用PCR、定量PCR、Southern blot、琼脂糖电泳、凝胶阻滞(EMSA)等实验方法,对预测序列在体内和体外结合实验两个方面验证MAR的存在和功能。
结果:通过MARFinder软件预测的MAR序列定位于2号染色体15991750bp-15992550bp。通过定量PCR发现预测出的这个MAR序列与核基质存在强结合。双荧光素酶报告基因的检测进一步表明,MAR序列能明显增强报告基因的表达。其中无论正向插入载体或反向插入载体均能增强荧光素酶报告基因的表达。
结论:(1)我们通过生物信息学对人卵巢癌细胞系UACC-1598中双微体2号扩增子上的280kb的DNA序列进行分析,预测出一个有价值的MAR。证明了双微体2号扩增子上存在MAR,且与核基质存在强结合。(2)MAR可以促进上下游基因的表达,可能参与促进双微体2号上MYCN基因的表达。2号染色体MYCN基因定位在16080683bp-16087129bp,与2号MAR相聚88133bp。提示MAR可能通过染色质的位置效应促进周围基因的表达,可能在双微体基因表达调控中发挥一定的作用。以上研究为我们对于了解双微体上的序列及其功能奠定了良好的基础。