【摘 要】
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临床研究证明,人cTnI和cTnT对于早期诊断急性心肌梗塞、冠状动脉综合症及心脏手术的愈后评估,是一项非常重要的生化指标。cTnI、cTnT是WHO推荐的用于检测心肌损伤的特异性较高的标志物。基于此,表达出具有免疫原性的人cTnI、cTnT蛋白,为将来开发心肌损伤的快速诊断试剂盒提供低成本的抗原,这将对以后临床上能快速、简单、准确地对心脏病患者进行早期诊断,降低心肌梗塞死亡率具有重要的价值和意义。
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临床研究证明,人cTnI和cTnT对于早期诊断急性心肌梗塞、冠状动脉综合症及心脏手术的愈后评估,是一项非常重要的生化指标。cTnI、cTnT是WHO推荐的用于检测心肌损伤的特异性较高的标志物。基于此,表达出具有免疫原性的人cTnI、cTnT蛋白,为将来开发心肌损伤的快速诊断试剂盒提供低成本的抗原,这将对以后临床上能快速、简单、准确地对心脏病患者进行早期诊断,降低心肌梗塞死亡率具有重要的价值和意义。本实验从人心脏总cDNA中获得cTnI,cTnT的全长基因,并将其插入到原核表达质粒pET-32a,构建重组质粒pET-32a-cTnI和pET-32a-cTnT,质粒经PCR、双酶切及测序鉴定后,将其转化到大肠杆菌BL21中,cTnI和cTnT蛋白在BL21菌株中以融合蛋白的可溶性形式获得高表达,western blotting检测呈阳性,蛋白大量提取后经Histrap HP纯化后可达到80%以上的纯度。同时,为了获得接近天然构象的cTnI蛋白,将cTnI片段插入到真核表达质粒pcDNA3.1V5His,pCI-neo及pEGFP-N2,构建了重组质粒pcDNA3.1-cTnI,pCI-neo-cTnI及pEGFP-cTnI。将真核重组质粒转染了COS-7细胞,在转染48h后western blotting检测到目的蛋白的表达。另外,将真核重组质粒转染了CHO细胞,在转染第二天用G418进行筛选,最终筛选出CHO-cTnI稳定细胞株5株,对其进行DNA,RNA及蛋白水平的检测,但其表达量较低,以至于无法进行下游的纯化工作。
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