背景胼胝体投射神经元(callosal projection neuron),也称作皮层间投射神经元,是投射神经元的一个重要亚型,大部分位居大脑皮层的“上层”(第Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ层),其轴突穿越大脑中线并投射至对侧大脑半球并形成广泛而复杂的神经网络。从进化学上来讲,胼胝体投射神经元为哺乳动物所特有,并随着哺乳动物的进化而进化和扩增;至人类,胼胝体投射神经元的数量远远超过另一种重要的投射神经元亚型—皮层下投射神经元(subcerebral projection neuron),被认为是执行大脑高级智能活动的物质主体。胼胝体(corpus callosum)是由胼胝体投射神经元的轴突汇集而成的实质结构,结构性并功能性地连接双侧大脑半球。胼胝体的出现是哺乳动物进化史上的创新,只出现在胎盘生哺乳动物中,而未出现在有袋哺乳类(marsupials),爬行类或其他脊椎动物。以人类和小鼠为例,现有的研究提示胼胝体神经元主要来源于胚胎期侧亚脑室层(subventricular zone,SVZ)的中间祖细胞(intermediate progenitors,IPCs),经过神经元的移行,穿越更早产生的,已经完成移行的皮层下投射神经元到达大脑皮层的上层。一旦到达它们移行的目的地,胼胝体投射神经元发出轴突,通过与轴突导向因子(axon guidance molecules)的介导,穿越中线到达对侧皮层的等位区(homotopic region)。胼胝体投射神经元和胼胝体的出现从脑的结构学和组织学上将哺乳动物和爬行动物区分开来,深刻地影响了哺乳动物,特别是胎盘生哺乳类以及灵长类脑和高级智能的进化。因而了解其发生,发育及进化的控制,调节和适应对了解智能的产生和进化有重要意义。虽然参与这一过程的一些分子已经被识别,但是决定胼胝体投射神经元的发生,分化,成熟的驱动因素以及其进化过程中的适应机制尚不清楚。研究证实转录因子及顺式作用元件的相互作用能够调控多种细胞的命运选择(cell fate choice),由此推理,可能存在一个或一系列在中间祖细胞中以及表达的转录因子,能够决定胼胝体投射神经元的分化,成熟和投射。通过研究胼胝体投射神经元特异性的转录组,以及其活跃顺式作用元件,有助于找到驱动其细胞命运选择的关键因子,并进一步了解其调控机制。目的:1,了解决定胼胝体投射神经元的发生,分化及成熟的分子生物学机制;2,了解控制胼胝体投射神经元以及胼胝体发生和发育的转录因子和顺式作用元件及其相互作用;3,从进化学上探讨造成哺乳类胼胝体投射神经元以及胼胝体发生的可能事件;4,探索顺式作用元件的进化和适应性突变在哺乳类胼胝体投射神经元以及胼胝体发生和演化,以及复杂神经网络和高级智能的发展和进化中的可能作用。方法:哺育两种由绿色荧光蛋白(GFP)标记的转基因小鼠,Fezf2-Gfp和Arpp21-Gfp,进行脑组织免疫荧光染色确定GFP标记的细胞分别为胼胝体投射神经元和皮层下投射神经元。分离出生第0天的小鼠的新皮层(neocortex)细胞,通过荧光激活细胞分选(流式细胞术,Fluoroscence activated cell sorting,FACS)筛选GFP标记的细胞。将一部分细胞提取RNA,进行RNA测序(RNA-seq)了解其转录;对另一部分FACS收集的Fezf2-Gfp阳性和Arpp21-Gfp阳性细胞,使用针对组蛋白3(Histone3)第27位赖氨酸(K27)的乙酰化的抗体(anti-H3K27ac)进行组蛋白免疫共沉淀并测序(Chromatin immuno-precipitation and sequencing,Ch IP-seq)了解其活跃的顺式作用元件。·分析RNA-seq及Ch IP-seq数据,对二者整合分析,筛选可能重要转录因子和可能胼胝体投射神经元增强子(candidate callosal projection neuron enhancers)。选取特征性的胼胝体投射神经元增强子-Cux2内含子增强子,使用重组DNA技术将其置于Gfp基因之前用来驱动其表达,将重组DNA使用原核注射的方法制作转基因小鼠,出生第0天筛选GFP阳性小鼠,切片并免疫荧光检测GFP表达的部位和细胞形态。分析增强子Cux2-E7 DNA序列中转录因子结合序列,与已筛选可能重要转录因子结合分析,进一步缩窄可能重要转录因子;将最终筛选出的转录因子克隆入表达载体,将Cux2-E7克隆入p GL4.24载体进行荧光素酶实验以测试其活性,初步选定Zbtb18是一个最可能的重要转录因子。制作Zbtb18敲除小鼠模型以及Zbtb18条件性敲除小鼠模型,研究其脑皮层表型变化;收集Zbtb18敲除小鼠及对照小鼠大脑皮层细胞进行RNA-seq,了解Zbtb18缺失情况下转录组的变化,从分子水平分析造成Zbtb18敲除小鼠表型的可能原因。给予孕鼠腹腔注射IDU,CIDU,BRDU标记新产生的皮层下投射神经元(孕12.5-13.5天注射)与胼胝体投射神经元(孕14.5-15.5天注射),于小鼠出生第0-1天取脑切片,使用免疫荧光染色检测标记神经元的产生和移行,共染神经元亚型特异性标记物了解其分化。哺育Zbtb18flox/flox;Neurod6-cre;Cag-Cat-Gfp小鼠,GFP相应地标记所有的皮层神经元及其投射。检测GFP标记的皮层投射神经元的投射变化。对RNAseq检测到的Zbtb18敲除小鼠的皮层中表达异常的轴突导向因子进行分析,结合其在皮层发育过程中的动态表达情况,选择其异常表达最可能导致胼胝体神经元投射异常的数个因子并克隆入真核表达载体。针对可能造成小鼠表型的因素进行多组胚胎电转染(in utero electroporation),试图挽救胼胝体神经元的分化,迁移及投射障碍。分析投射神经元增强子内部ZBTB18结合序列在脊柱动物进化过程中的保守性;人为地在鼠来源的Cux2增强子及Bcl11b增强子中引入爬行类和有袋哺乳类相应的单核苷酸突变,并载体并进行荧光素酶实验检测其活性变化。结果:第一部分控制胼胝体投射神经元以及胼胝体发生和发育的转录因子和顺式作用元件及其相互作用1.脑组织免疫荧光染色显示GFP标记的Fezf2-Gfp和Arpp21-Gfp细胞分别为胼胝体神经元和皮层下投射神经元。2.通过荧光激活细胞分选分别收集30 million的Fezf2-Gfp阳性和Arpp21-Gfp阳性细胞;RNA测序(RNA-seq)显示其转录组与已有类似研究所报道的胼胝体神经元和皮层下投射神经元相似。3.组蛋白免疫共沉淀并测序(Ch IP-seq)显示,从全基因组水平上Fezf2-Gfp细胞分标记的皮层下投射神经元和Arpp21-Gfp标记的胼胝体神经元在大多数位点其表观遗传学标记物H3k27ac信号相似,然而在一些特异位点,例如Cux2,Cux2,Satb2,Robo1,Robo2,Fezf2等,两种神经元具有不同的H3k27ac信号。对RNA-seq及Ch IP-seq数据的整合分析,筛选可能重要转录因子和可能胼胝体投射神经元增强子(candidate callosal projection neuron enhancers)。Cux2内含子增强子E7显示其H3K27ac信号仅在Arpp21-Gfp细胞中富集,并不在Fezf2-Gfp细胞中富集,因而是一个特征性的胼胝体神经元增强子。4.Cux2内含子增强子E7驱动GFP表达的转基因小鼠其GFP表达局限于皮层Ⅱ-Ⅳ层的胼胝体投射神经元。5.分析增强子Cux2-E7 DNA序列中转录因子结合序列,与已筛选可能重要转录因子结合分析,进一步缩窄可能重要转录因子;将最终筛选出的转录因子克隆入表达载体,将Cux2-E7克隆入p GL4.24载体进行荧光素酶实验以测试其活性,初步选定Zbtb18是一个最可能的重要转录因子。6.制作Zbtb18敲除小鼠模型以及Zbtb18全皮层条件性敲除小鼠模型,研究其脑皮层表型变化,发现在缺失Zbtb18的情况下,大脑皮层CPN聚集的第Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ严重发育不良,胼胝体缺失,而皮层以Sc PN为主的第V,VI层尚存。第二部分ZBTB18控制哺乳类胼胝体投射神经元命运选择的生物学过程和分子机制1.对孕13.5,14.5,16.5及18.5天Zbtb18敲除小鼠胚胎的大脑皮层,用免疫荧光染色检测主要神经元亚型标记物的表达情况发现,ZBTB18在胎盘生哺乳动物(包括小鼠,人类)的胚胎期的亚脑室层,过渡层以及发育期神经元中高度表达;ZBTB18与CPN标记物SATB2,CUX2高度共表达,与Sc PN标记物BCL11B很少或不共表达。2.收集Zbtb18敲除小鼠及对照小鼠大脑皮层细胞进行RNA-seq,了解Zbtb18缺失情况下转录组的变化,从分子水平分析造成Zbtb18敲除小鼠表型的可能原因,结果显示ZBTB18缺陷小鼠的皮层向以皮层下投射神经元(Sc PN)为主的特征转变。3.对神经元特异性ZBTB18敲除小鼠Zbtb18flox/flox;Neurod6-cre的皮层进行研究显示,与ZBTB18全皮层条件性敲除小鼠类似,大脑皮层CPN聚集的第Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ严重发育不良,CPN主要标记物CUX1,CUX2表达缺失,BCL11B表达上升。4.Zbtb18fl/fl;Neurod6-cre小鼠的CPN的树突和树突棘(dendritic spine)显示严重发育障碍。5.给予孕鼠腹腔注射IDU,CIDU,BRDU标记新产生的皮层下投射神经元(孕12.5-13.5天注射)与胼胝体投射神经元(孕14.5-15.5天注射),于小鼠出生第0-1天取脑切片,使用免疫荧光染色检测标记神经元的产生(genesis)和移行(migration),共染神经元亚型特异性标记物了解其分化(differentiation);结果显示胼胝体投射神经元移行发生障碍,并且不再表达其特异性标记物,反而表达皮层下投射神经元特异性标记物 BCL11B。6.Zbtb18fl/fl;Neurod6-cre小鼠的神经发生表型与Zbtb18fl/fl;Emx1-cre一致,提示此表型为神经元自主性,而非单纯由于祖细胞障碍所致。SATB2在CPN中表达延迟,BCL11B在CPN中异位表达是ZBTB18缺失后的突出表型。7.克隆特异性针对Bcl11b m RNA的micro RNA的真核表达载体。在孕鼠孕14.5-15.5进行胚胎电转染(in utero electroporation)将表达特异性针对Bcl11b m RNA的micro RNA的载体传递至侧脑室层的祖细胞,试图挽救胼胝体神经元的分化,迁移及投射障碍,结果显示si RNA knockdown Bcl11b能够挽救ZBTB18缺失的表型。8.分析Bcl11b增强子中转录因子结合序列的富集情况,是否有确定的ZBTB18结合序列;将含有确定ZBTB18结合序列的增强子克隆入p GL4.24载体并进行荧光素酶实验检测其活性在增强ZBTB18剂量后的的反应,结果显示ZBTB18直接抑制Bcl11b-E3的活性来抑制Bcl11b在CPN中表达。第三部分 BTB18调控胼胝体形成的神经元自主性机制1.哺育Zbtb18flox/flox;Neurod6-cre;Cag-Cat-Gfp小鼠,GFP相应地标记所有的皮层神经元及其投射。检测GFP标记的皮层投射神经元的投射变化。结果显示Zbtb18fl/fl;Neurod6-cre;CAG-CAT-GFP小鼠大脑GFP所标记的胼胝体缺失,海马联合和前联合也缺失。2.在孕鼠孕14.5-15.5进行胚胎电转染,将ZBTB18表达载体传递至侧脑室层的祖细胞,试图挽救胼胝体神经元的分化,迁移及投射障碍;结果显示ZBTB18能够完全挽救Zbtb18fl/fl;Neurod6-cre小鼠大脑的CPN移行和投射障碍。3.对RNA-seq检测到的Zbtb18敲除小鼠的皮层中表达异常的轴突导向因子进行分析,发现ZBTB18敲除小鼠转录组中多个轴突导向因子的表达发生变化,分析Zbtb18缺失小鼠的RNA测序结果显示多个轴突导向因子表达紊乱,包括Robo1,Robo2,Dcc,Unc5d表达下降和Robo3表达上升。4.结合轴突导向因子在皮层发育过程中的动态表达情况,选择其异常表达最可能导致胼胝体神经元投射异常的数个因子进行RNA原位杂交验证其表达的变化。5.将轴突导向因子编码序列克隆入p GAGIG表达载体并进行胚胎电转染实验。通过胚胎电转将ROBO1在e14.5-15.5转导至Zbtb18缺陷小鼠皮层祖细胞能够部分挽救CPN的移行和投射,但是使用DCC或UNC5D不能拯救CPN的移行和投射缺陷.第四部分顺式作用元件的进化可能促进了哺乳动物胼胝体投射神经元以及胼胝体发生和进化1.分析投射神经元增强子内部ZBTB18结合序列在脊柱动物进化过程中的保守性;以ROBO增强子为例,3个ROBO增强子仅在胎盘生哺乳动物中出现,而未在爬行类及鸟类出现。2.胼胝体神经元重要增强子的进化与6层皮层结构的出现以及胼胝体的出现相吻合。Cux2-E7及Bcl11b-E3的第一次次进化学变异出现在哺乳类从爬行类分离出来之后,与CPN在进化学上的出现一致;其第二次变异,以及Robo1与Robo3增强子的出现与胼胝体的出现时间一致,在胎盘生哺乳类和有袋哺乳类分离之后。3.人为地在鼠来源的Cux2增强子及Bcl11b增强子中引入爬行类和有袋哺乳类相应的单核苷酸突变,并载体并进行荧光素酶实验检测其活性变化。将小鼠Cux2以及Bcl11b增强子中ZBTB18结合序列引入等同于爬行类或者有袋哺乳类的单核苷酸突变导致增强子的反应性异常升高或降低。结论:1.ZBTB18(RP58/ZFP238)通过直接结合增强子调节转录因子以及轴突诱导受体,内在性地决定胼胝体投射神经元的命运和投射。2.ZBTB18调控这一过程的关键机制为过调节胼胝体神经元的增强子活性来活化胼胝体神经元标记物CUX2的表达,并同时抑制BCL11B,一个重要的皮层下投射神经元标记物的表达,且这一机制为哺乳动物所特有。3.投射神经元增强子序列的突变很可能参与了哺乳动物胼胝体投射神经元以及胼胝体的发生和演化,以及与之相对应的复杂神经网络和高级智能的发展和进化。