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背景及目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为糖尿病(diabetic mellitus,DM)最常见且最严重的并发症之一,在欧美国家中,DN是引起终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)的首位病因。糖尿病肾病早期即可发生炎性因子分泌失调控,进而通过不同的作用机制损害肾脏结构及功能,最终加速疾病的进展。作为肾脏滤过屏障最为重要的组分,足细胞受到炎性因子损害的现象日益受到关注。但糖尿病肾病炎症发生机制复杂,急需探索新的治疗方案来延缓糖尿病肾病的进展。Sirt1(Sirtuins 1)是一种营养及代谢相关蛋白,具有调节表观遗传基因沉默、抑制r RNA重组等作用。有研究指出Sirt1与足细胞的损伤关系密切,且能够参与调控糖尿病肾病炎症反应,但相关机制仍需进一步探讨。TTP(Tristetraprolin)是一种AREs(AU-rich elements)结合蛋白,可直接与炎症因子TNF-α及IL-6的m RNA 3’UTR的AU区段结合,进而发挥抗炎作用。TTP的蛋白量及与目的m RNA的结合能力主要受TTP的磷酸化水平影响。TTP具有多个磷酸化位点,可被多种蛋白磷酸化。而P38-MAPK是一种可磷酸化TTP的重要酶,在多种细胞活动中发挥关键作用,是细胞信号传导的重要通路。多项研究表明,Sirt1可通过P38-MAPK信号通路参与调控炎症反应。而Sirt1是否能够通过P38-MAPK信号通路来调控TTP的表达,进而参与糖尿病肾病的炎症反应、引起足细胞损伤,尚未有研究报道。本实验从细胞水平探究Sirt1在高糖诱导的足细胞炎症反应及损伤中发挥的作用及具体机制。方法体外贴壁培养条件永生化小鼠足细胞(conditionally immortalized mouse podocyte,MPC),先将MPC置于含10%胎牛血清、5.6mmol/L葡萄糖和4ng/ml小鼠γ-干扰素的RPMI 1640培养基,33℃、5%CO2细胞培养箱中增殖培养;然后将MPC置于含10%胎牛血清、5.6mmol/L葡萄糖、不含小鼠γ-干扰素的RPMI1640培养基,37℃、5%CO2细胞培养箱中分化培养。0.25%胰酶消化,按需传代,待细胞分化成熟后,随机分为以下9组:(1)正常糖浓度组(含5.6mmol/L D-葡萄糖);(2)甘露醇组(含5.6mmol/L D-葡萄糖+19.4mmol/L D-甘露醇);(3)高糖浓度组(含25mmol/L D-葡萄糖);(4)正常糖+转染对照组;(5)正常糖+Sirt1 siRNA转染组;(6)正常糖+空白对照慢病毒组;(7)正常糖+过表达Sirt1慢病毒组;(8)高糖+空白对照慢病毒组;(9)高糖+过表达Sirt1慢病毒组。实验处理后36h、48h收集细胞,分别提取细胞总RNA和总蛋白,然后应用q RT-PCR和Western blot在基因及蛋白水平上检测Sirt1、P38-MAPK、TTP、足细胞标记蛋白Nephrin、Podocin、损伤因子Desmin以及炎症因子IL-6、IL-18的表达水平。结果1.高糖条件下足细胞中Sirt1、TTP、Nephrin及Podocin的m RNA和蛋白表达减少(P<0.05),Desmin、IL-6及IL-18的m RNA和蛋白表达增多(均P<0.05),P38-MAPK的表达无明显变化(P>0.05),而p-P38-MAPK(即磷酸化的P38-MAPK)的蛋白表达增多(P<0.05)。2.细胞免疫荧光双染色显示,正常糖浓度及高糖条件下足细胞中P38-MAPK与TTP的表达均存在共定位现象。免疫共沉淀也验证了P38-MAPK蛋白能与TTP蛋白结合。3.利用siRNA下调Sirt1的表达后,和正常糖浓度组相比,足细胞中Sirt1、TTP、Nephrin及Podocin的m RNA和蛋白表达降低(P<0.05),Desmin、IL-6及IL-18的m RNA和蛋白表达增多(均P<0.05),P38-MAPK的表达无明显变化(P>0.05),而p-P38-MAPK的蛋白表达增多(P<0.05)。4.利用慢病毒上调Sirt1的表达后,与各自未转染慢病毒组相比,足细胞中Sirt1、TTP、Nephrin及Podocin的m RNA和蛋白表达增多(P<0.05),Desmin、IL-6及IL-18的m RNA和蛋白表达减少(均P<0.05),P38-MAPK的表达无明显变化(P>0.05),而p-P38-MAPK的蛋白表达减少(P<0.05)。结论1.Sirt1的缺失能够诱导足细胞炎症反应和损伤。2.上调Sirt1的表达后能够缓解高糖诱导的足细胞炎症反应和损伤。3.高糖环境下Sirt1可能是通过调控足细胞中P38-MAPK的磷酸化水平进而影响TTP的表达,最终导致足细胞发生炎症反应和损伤。