论文部分内容阅读
目的:本课题前期研究表明扶肝化纤汤可改善肝纤维化大鼠血清指标及肝组织病理变化。在此基础上,我们结合中医基础理论,建立“正虚毒蕴血瘀”病证结合HF大鼠模型,并从MAPK信号通路角度探讨扶肝化纤汤对正虚毒蕴血瘀病证结合肝纤维化模型大鼠的影响。方法:清洁级SD大鼠120只,适应性喂养一周,称重并随机分为六组,每组20只,分别为正常对照组(A组)、模型组(B组)、秋水仙碱治疗组(C组)、扶肝化纤汤高剂量组(D组)、扶肝化纤汤中剂量组(E组)、扶肝化纤汤低剂量组(F组)。除正常组外,余下各组大鼠在采用经典四氯化碳(CC14)皮下注射诱导大鼠肝纤维化基础上,以中医理论为指导,建立“正虚毒蕴血瘀”病证结合肝纤维化大鼠模型;造模6周后,从每组中各随机抽取2只,进行HE、Masson染色观察大鼠肝组织炎症、坏死表现及肝纤维化程度,验证模型成功后,从第7周开始给药,根据人与大鼠的临床等效量换算大鼠给药剂量,并按照1:2:4方法选择低中高剂量,药物剂量据大鼠体重变化进行调整。对照组(纯净水灌胃2ml/d)、模型组(纯净水灌胃2ml/d)、秋水仙碱治疗组(2mg·kg-1·d-1)、扶肝化纤汤高剂量治疗组(67.08g·kg-1·d-1)、扶肝化纤汤中剂量治疗组(33.54g·kg-1·d-1)、扶肝化纤汤低剂量治疗组(16.77g·kg-1·d-1),连续灌胃干预3周,末次灌胃的次日,观察各组大鼠一般情况及体重变化,于禁食12小时后处死大鼠,取血及肝组织冻存于-80℃冰箱备用。采用微板法测定天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、微量酶标仪法测定白蛋白(ALB)、碱水解法测定羟脯氨(Hyp)的含量、ELISA法测定Ⅲ型前胶原肽(PⅢNP)、层粘连蛋白(LN)水平。采用HE、Masson染色在光镜下观察治疗后大鼠肝损伤程度及病理学情况。运用Western-Blot法检测肝组织MAPK信号通路中ERK1/2、JNK1/2、P38相关蛋白及其磷酸化蛋白表达情况,定量分析结果以P-ERK/ERK、P-JNK/JNK、P-P38/P38比值表示,探讨扶肝化纤汤通过MAPK信号通路对HF产生的作用及影响。结果:“正虚毒蕴血瘀”病证结合肝纤维化大鼠模型造模成功。各治疗组大鼠一般情况较正常对照组差,明显优于模型组,但治疗组之间比较无明显差异。除模型组外,各组大鼠体重均有增加(P<0.01或P<0.05),各治疗组之间体重比较无明显差异。在血清ALT、AST、ALB及Hyp、LN、PⅢNP中,治疗组与模型组比较均有改善,以高剂量组最为明显(P<0.05);扶肝化纤汤中、低剂量组与秋水仙碱组之间比较无明显差异(P>0.05)。HE染色肝组织病理切片提示,与模型组相比,扶肝化纤汤高剂量组有少量胶原纤维沉积及炎性细胞浸润,肝索排列相对齐整,无假小叶形成;秋水仙碱组与扶肝化纤汤中、低剂量组之间比较无明显差异,均有不同程度的胶原纤维增生及肝细胞变性和坏死,少部分有不完全假小叶形成,肝索结构混乱,大量炎性细胞浸润。Masson染色肝组织病理切片显示,与模型组相比,秋水仙碱组与扶肝化纤汤中、低剂量组小叶结构基本存在,汇管区域扩大,纤维组织增生。扶肝化纤汤高剂量组小叶结构完整,少量纤维组织增生,改善肝纤维化的效果最明显。Western-Blot结果显示:P38、ERK1/2、JNK1/2在各组组间中无统计学差异。P-P38、P-P38/P38、P-ERK1/2,P-ERK/ERK、P-JNK1/2、P-JNK/JNK 比值在正常对照组与模型组、治疗组之间有统计学差异,其中模型组较治疗组表达显著上调,各治疗组中以扶肝化纤汤高剂量组表达最低,与中、低、秋水仙碱治疗组比较有统计学意义(P<0.01或P<0.05),扶肝化纤汤低剂量组与秋水仙碱、高、中剂量组两两比较无统计学差异。结论:1.采用CCL4橄榄油合剂皮下注射并结合中医基础理论建立“正虚毒蕴血瘀”病证结合HF大鼠模型。2.扶肝化纤汤能够降低“正虚毒蕴血瘀”病证结合肝纤维化大鼠模型的血清(ALT、AST、HYP、LN、PⅢNP)含量,升高ALB的血清含量。3.扶肝化纤汤能够减轻大鼠肝组织纤维化程度。4.扶肝化纤汤可能是下调P-P38、P-ERK1/2、P-JNK1/2的表达来缓解或调控肝纤维化。