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丰加霉素（Toyocamycin,TM）是核苷类抗生素家族的成员之一，其在植物病原真菌防治领域具有较好的研究和应用潜力。课题组前期筛选出一株丰加霉素生产菌淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）1628。丰加霉素由鸟苷三磷酸（Guanosine triphosphate,GTP）为前体通过多步反应合成。前期课题组利用核糖体工程获得一株高产丰加霉素的利福平抗性突变株S.diastatochromogenes1628-T15，比较蛋白组学为技术手段,分析了原始菌1628与高产突变株1628-T15的差异蛋白。本论文从嘌呤代谢途径（Purine metabolism）的差异蛋白入手，利用前体代谢工程等手段，研究前体GTP合成对丰加霉素产量的影响。本论文主要研究工作如下：
首先，以高产突变株1628-T15和原始菌1628为研究对象，基于比较蛋白组学数据分析、KEGG数据库比对筛选到嘌呤代谢途径中五个差异蛋白，其中：X0NBV6、X0P2N4、A0A059W736、A0A059VSQ4分别编码磷酸核糖焦磷酸激酶（ribose-phosphate pyrophosphokinase）、GMP合酶（GMP synthase）、核苷二磷酸激酶（nucleoside-diphosphate kinase）、鸟苷酸激酶（guanylate kinase），这四个差异蛋白在突变株1628-T15中的表达量显著提高；而A0A059WBI4编码的5’-核苷酸酶（5-nucleotidase）表达量显著降低；同时检测了不同发酵时间段突变株1628-T15和原始菌株1628的胞内的GTP含量，结果发现，在发酵前期（12-36h）突变株1628-T15中前体物质GTP的含量均高于原始菌1628，增幅为90%至102.5%，为丰加霉素的合成提供了大量的前体。将5个差异蛋白在S.diastatochromogenes1628基因组对应编码的基因分别命名为rhpsd、guasd、ndksd、guaKsd、nucsd。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示，基因rhpsd、guasd、ndksd、guaKsd在突变株1628-T15中的表达量是原始菌1628的4.50倍、2.23倍、1.78倍、1.48倍，而nucsd的表达量仅为原始菌株1628的37%。
其次，为验证5个差异基因与GTP合成以及丰加霉素产量的相关性，扩增了1628中的基因rhpsd、guasd、ndksd、guaKsd、nucsd，并置于质粒pIB139中组成型启动子permE*的下游表达，成功构建了重组质粒pIB139-rhpsd、pIB139-guasd、pIB139-ndksd、pIB139-guaKsd和pIB139-nucsd。将以上5个质粒通过接合转移法分别整合至S.diastatochromogenes1628染色体，通过表型和分子验证成功获得的重组菌分别命名为1628-RP，1628-GA，1628-NK，1628-GK和1628-NC。为进一步探究五个差异基因的功能奠定了基础。
最后，对5株重组菌不同发酵时间段对应差异基因的转录水平、丰加霉素产量，胞内GTP浓度进行分析，qRT-PCR结果显示，各重组菌中相应的过表达基因在整个发酵过程中均处于高表达水平，该结果证明差异基因在重组菌中已成功实现过表达。研究发现，与原始菌株1628相比，重组菌1628-RP，1628-GA、1628-NK、1628-GK的胞内GTP浓度和丰加霉素的产量均有不同程度的提高，GTP含量提高幅度在发酵前期最为明显，为10%至122%。四株重组菌的丰加霉素产量提高幅度在37%至134%，其中重组菌1628-RP中的丰加霉素产量提高最为显著，达到340.2mg/L，比原始菌1628高133.3%。结果说明基因rhpsd、guasd、ndksd、guaKsd的过表达增强了菌株GTP合成能力，从而促进了丰加霉素的合成。而重组菌1628-NC与原始菌株1628相比，发酵前期胞内GTP合成量减少仅有7.2mmol/mg DCW，下降了36.1%，其丰加霉素产素水平仅有67.1mg/L较原始菌1628下降53.9%。由此可见基因nucsd的过表达不利于GTP的积累从而一定程度上影响了丰加霉素的合成。以上结果不仅证实本文研究的5个差异蛋白与蛋白组分析结果相吻合，同时也证实增强前体GTP的合成有利于丰加霉素的合成，为进一步利用前体工程技术提高丰加霉素的产量奠定了基础。
首先，以高产突变株1628-T15和原始菌1628为研究对象，基于比较蛋白组学数据分析、KEGG数据库比对筛选到嘌呤代谢途径中五个差异蛋白，其中：X0NBV6、X0P2N4、A0A059W736、A0A059VSQ4分别编码磷酸核糖焦磷酸激酶（ribose-phosphate pyrophosphokinase）、GMP合酶（GMP synthase）、核苷二磷酸激酶（nucleoside-diphosphate kinase）、鸟苷酸激酶（guanylate kinase），这四个差异蛋白在突变株1628-T15中的表达量显著提高；而A0A059WBI4编码的5’-核苷酸酶（5-nucleotidase）表达量显著降低；同时检测了不同发酵时间段突变株1628-T15和原始菌株1628的胞内的GTP含量，结果发现，在发酵前期（12-36h）突变株1628-T15中前体物质GTP的含量均高于原始菌1628，增幅为90%至102.5%，为丰加霉素的合成提供了大量的前体。将5个差异蛋白在S.diastatochromogenes1628基因组对应编码的基因分别命名为rhpsd、guasd、ndksd、guaKsd、nucsd。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示，基因rhpsd、guasd、ndksd、guaKsd在突变株1628-T15中的表达量是原始菌1628的4.50倍、2.23倍、1.78倍、1.48倍，而nucsd的表达量仅为原始菌株1628的37%。
其次，为验证5个差异基因与GTP合成以及丰加霉素产量的相关性，扩增了1628中的基因rhpsd、guasd、ndksd、guaKsd、nucsd，并置于质粒pIB139中组成型启动子permE*的下游表达，成功构建了重组质粒pIB139-rhpsd、pIB139-guasd、pIB139-ndksd、pIB139-guaKsd和pIB139-nucsd。将以上5个质粒通过接合转移法分别整合至S.diastatochromogenes1628染色体，通过表型和分子验证成功获得的重组菌分别命名为1628-RP，1628-GA，1628-NK，1628-GK和1628-NC。为进一步探究五个差异基因的功能奠定了基础。
最后，对5株重组菌不同发酵时间段对应差异基因的转录水平、丰加霉素产量，胞内GTP浓度进行分析，qRT-PCR结果显示，各重组菌中相应的过表达基因在整个发酵过程中均处于高表达水平，该结果证明差异基因在重组菌中已成功实现过表达。研究发现，与原始菌株1628相比，重组菌1628-RP，1628-GA、1628-NK、1628-GK的胞内GTP浓度和丰加霉素的产量均有不同程度的提高，GTP含量提高幅度在发酵前期最为明显，为10%至122%。四株重组菌的丰加霉素产量提高幅度在37%至134%，其中重组菌1628-RP中的丰加霉素产量提高最为显著，达到340.2mg/L，比原始菌1628高133.3%。结果说明基因rhpsd、guasd、ndksd、guaKsd的过表达增强了菌株GTP合成能力，从而促进了丰加霉素的合成。而重组菌1628-NC与原始菌株1628相比，发酵前期胞内GTP合成量减少仅有7.2mmol/mg DCW，下降了36.1%，其丰加霉素产素水平仅有67.1mg/L较原始菌1628下降53.9%。由此可见基因nucsd的过表达不利于GTP的积累从而一定程度上影响了丰加霉素的合成。以上结果不仅证实本文研究的5个差异蛋白与蛋白组分析结果相吻合，同时也证实增强前体GTP的合成有利于丰加霉素的合成，为进一步利用前体工程技术提高丰加霉素的产量奠定了基础。