1研究背景核心中药处方的筛选,就是对可能治疗疾病的中药或其成分,采用相对适用的方法或技术,发现中药或其成分可能存在的药用功效或药理活性,进而为指导疾病的有效治疗和新药的开发提供有效的理论依据。目前,筛选治疗疾病的中药处方的方法主要有两大类:一是传统的模式:基于中医理论的指导和临床经验的指导,但限制了新药的发现;二是高通量药物筛选技术:具有快速、微量、便捷的特点,但未考虑中药治疗疾病的过程中如患者机体整体性和辨证论治等多种因素的影响。且基于疾病的病理机制和药物的药理机制的复杂性,针对单一靶点的疾病治疗和药物研发模式的局限性已经日益凸显。系统生物学和网络药理学的兴起,使药理机制研究及新药研发从传统的“单组分、单靶点”的研究模式向“多组分、多靶点”的方向发展。面对多组学研究产生的海量数据,网络分析作为一种新的工具,可以整合药物、靶点和疾病之间的关系,且生物网络与中医药的结合为中药药理、组方配伍机制的研究带来了新的思路,同时也是新药研发的热点。但由于网络结构的复杂性,给规律的探寻带来了极大的挑战,因此,对复杂的生物网络进行模块化解构和分析成为网络药理学和系统生物学新的研究方向。模块药理学认为基于对复杂的生物网络进行模块化分析,通过调节多靶点相互作用的模块来平衡疾病网络,可达到疾病治疗目标。且在疾病和药物研究领域,靶点模块的识别是在系统和网络水平下揭示中药多靶点协同作用机制的重要环节。这种基于模块药理学的中药复方发现技术将会为药物研发和疾病治疗提供新的机遇。因此,本研究针对中医药治疗疾病和药物研发模式面临的困境和基于模块药理学的多组学、多靶点网络分析的特点,以尿路感染膀胱湿热证为例,构建了网络的建立、网络模块的识别和核心模块的判定体系和基于核心模块的中药处方的筛选模型,这为中药治疗疾病和中药新药的研发提供了一种新的思路和研究方法。2研究目的通过两种不同的获取数据的途径,运用网络的方法去分析尿路感染膀胱湿热证,从而筛选出两种治疗尿路感染膀胱湿热证的核心中药处方,并采用细胞实验验证或文献验证的方法对结果进行验证,进而从网络的角度来预测治疗尿路感染膀胱湿热证的核心中药处方。3研究方法3.1数据的获取3.1.1治疗尿路感染膀胱湿热证的中药的获取通过中成药价值评估信息数据库(http://crds.release.daodikeji.com)获得治疗尿路感染膀胱湿热证的已上市中成药,经过去重、统一名称等处理后,得到治疗尿路感染膀胱湿热证的中药。3.1.2与尿路感染膀胱湿热证主要症状关联的优选基因的获取通过HPO 数据库(http://human-phenotype-ontology.github.io/)和 Disease Ontology数据库(http://www.disease-ontology.org/)获得与尿路感染膀胱湿热证主要症状相关联的基因,并对其进行去重、统一名称等处理。并对得到的与尿路感染膀胱湿热证主要症状关联的基因,进行Fisher精确检验法统计分析,最终得到与尿路感染膀胱湿热证主要症状相关联的优选基因(P<0.05)。3.2网络的构建3.2.1中药网络的创建首先根据Apriori算法对获得的治疗尿路感染膀胱湿热证的中药进行关联分析,然后将对中药关联分析的结果输入至Cytoscape 3.6.0软件中,构建出疾病-中药网络,并将其可视化。3.2.2主要症状-基因网络的构建我们把已经获取的与尿路感染疾病主要症状关联的优选基因提交到String数据库,选择人类为背景,该网站自动构建出与尿路感染膀胱湿热证主要症状相关联的基因网络。3.3网络的模块划分获取中药/基因网络数据之后,使用Cytoscape 3.6.0软件中的插件MCODE、MCL和Cytocluster三种算法分别对尿路感染膀胱湿热证-中药网络和尿路感染膀胱湿热证主要症状-基因网络进行模块的划分,并将其可视化。3.4熵值的计算应用熵值算法判定MCODE、MCL和Cytocluster这三种不同方法对网络模块识别的效果,其中熵值越小代表用该方法进行模块识别后模块的离散程度越小,稳定性越高;然后我们选取熵值最小的方法去识别网络的模块。3.5网络核心模块的识别我们根据熵值选择出最优的模块划分方法对网络进行模块识别,然后依据节点强度、介数中心性和页面等级排序这三种方法对每个模块进行排序,得到各组排名第一的模块即为候选核心模块。3.6筛选核心处方3.6.1基于中药网络,筛选核心中药处方针对治疗尿路感染膀胱湿热证的中药网络,我们筛选出了治疗尿路感染膀胱湿热证的核心模块,我们认为该模块所含的中药节点即为治疗尿路感染膀胱湿热证的核心中药,然后我们根据核心模块中的中药在该模块中的度中心性的大小来判断处方中中药的君臣佐使。3.6.2基于疾病主要症状-基因网络,筛选核心中药处方我们对尿路感染膀胱湿热证的主要症状-基因网络,进行了网络核心模块的识别,对得到的网络核心模块所含的基因的蛋白成分进行分析;再基于TCMSP和CTD数据库,建立“基因-蛋白成分-中药”关联,找到核心模块所关联的中药,并对得到的中药进行统计学分析,得到基于尿路感染膀胱湿热证主要症状-基因网络,筛选出的核心中药;然后我们根据筛选出的中药的频次,来判断处方中中药的君臣佐使。3.7结果验证基于上述筛选出来2种基于网络核心模块的治疗尿路感染膀胱湿热证的核心处方,我们采用文献验证或细胞实验验证的方法对结果进行验证。4研究结果4.1数据的获取结果我们基于中成药价值评估信息数据库,共搜索出治疗尿路感染膀胱湿热证的27种中成药和108味中药。通过在HPO和Disease Ontology这两个数据库中下载与疾病症状关联的数据,筛选与尿路感染疾病膀胱湿热证的主要症状相关联的基因,最终得到与尿路感染膀胱湿热证的主要症状相关联的优选基因共573个(P<0.05)。4.2网络的构建我们运用Cytoscape软件构建治疗尿路感染膀胱湿热证的中药网络,该网络由107个节点,744条边组成。基于尿路感染膀胱湿热证的主要症状相关联的优选基因,我们运用String(https://string-db.org/)数据库(背景为Homo sapiens)构建尿路感染膀胱湿热证主要症状-基因网络,该网络由522个节点,4411条边组成。4.3网络模块的划分和熵值的计算通过用MCODE、MCL和Cytocluster三种方法对两个网络均进行模块的划分,可知运用MCODE的方法对网络进行模块的划分的熵值最小。因此我们最终决定用MCODE的方法对两个网络进行模块划分。4.4网络核心模块的识别我们运用MCODE的方法对两个网络进行模块划分,然后对各个模块主次关系进行排序,最终在中药网络中,5号模块为核心模块;而在主要症状-基因网络中,1号模块为该网络的核心模块。4.5治疗尿路感染膀胱湿热证的两种中药处方基于治疗尿路感染膀胱湿热证-中药网络,我们筛选出了治疗尿路感染膀胱湿热证的核心模块,得到治疗尿路感染膀胱湿热证的核心中药处方为:桑寄生、柴胡、五味子、续断、白芷、冬葵果、半枝莲、石韦、金银花、赤芍、白花蛇舌草、仙鹤草。基于尿路感染膀胱湿热证主要症状-基因网络,最终得到治疗尿路感染膀胱湿热证的核心中药处方为:丹参、甘草、五味子、草果、麻黄、淫羊藿、柴胡、银杏叶、延胡索、巴戟天和苦参。5结论我们以尿路感染膀胱湿热证为例,分别建立了尿路感染膀胱湿热证的中药网络和主要症状-基因网络,运用了三种不同的模块划分的方法对网络进行模块的划分,最终发现了 MCODE方法对网络模块的划分最适用,且依据三种计算方法识别出了两个不同网络的核心模块,结合了中药复方和模块网络分析中“多靶点,多组分”的模式,并建立了两种基于核心模块的中药处方配伍理论,最终从两种不同的角度发现了治疗尿路感染膀胱湿热证的核心中药处方:桑寄生、柴胡、五味子、续断、白芷、冬葵果、半枝莲、石韦、金银花、赤芍、白花蛇舌草、仙鹤草和丹参、甘草、五味子、草果、麻黄、淫羊藿、柴胡、银杏叶、延胡索、巴戟天和苦参。且我们通过文献验证和细胞试验验证可知这两种中药处方对尿路感染膀胱湿热证均有一定的治疗效果。这为治疗疾病的核心中药的发现和新药研发的模式提供了 一种新的思路和研究方法。