目的:利用脂肪间充质干细胞作为种子细胞复合实验室自主研发的壳聚糖水凝胶支架构建组织工程软骨,并修复兔关节软骨缺损,探讨一种适用于临床治疗的关节软骨缺损修复方法。方法:(1)脂肪间充质干细胞的体外培养和鉴定:取24周龄新西兰大白兔皮下脂肪,胶原酶消化后体外扩增培养得到脂肪间充质干细胞,通过定向分化为软骨细胞鉴定其多能性。(2)壳聚糖水凝胶的制备:1,6-己二酸异氰酸酯和聚乙二醇-400制备壳聚糖水凝胶的交联剂,将所得的交联剂加入2%(wt%)的壳聚糖溶液,室温下混合均匀后得到壳聚糖水凝胶,凝胶冻干后备用。(3)组织工程软骨的体外构建:脂肪间充质干细胞种植于灭菌后的壳聚糖水凝胶上,体外培养1周构建组织工程软骨。(4)关节软骨缺损修复评价:制作兔关节软骨缺损模型,并将动物随机分为3组。A组为对照组,B组为壳聚糖水凝胶材料组,C组为实验组,即植入体外初步构建的组织工程软骨的动物。分别于术后4周、8周、12周取样,通过大体观察、HE染色、Safranin-O及Collagen II免疫组化染色等方法观察缺损关节软骨的修复情况,并用国际关节软骨修复协会ICRS制定的评分法进行大体及组织学评分。结果:(1)体外培养获得大量兔脂肪间充质干细胞,经鉴定其能很好的向软骨细胞分化,表明其完全可以作为组织工程软骨构建种子细胞来源。(2)大体观察可见:实验组兔在植入组织工程软骨后其缺损软骨得到了明显修复,新生组织与正常组织结合紧密,其结构和胞外基质的分泌情况类似于正常组织。材料组由于壳聚糖凝胶本身对缺损部位的填充,因此大体观可见新生组织填充,其新生组织也有一定的透明软骨层,但新生组织结合不够紧密,缺损处仍有明显凹陷。对照组动物大体观察显示,虽然损伤部位有白色新生组织填充,但组织之间结合不够紧密,新生组织与正常组织之间存在明显的界限。(3)H&E染色、Safranin-O染色和COLⅡ免疫化学染色结果显示:实验组新生组织表面为软骨层,新生组织的结构与正常软骨类似,具有透明软骨所特有的软骨陷窝、细胞外基质的分泌情况良好。材料组织学染色结果显示,凝胶材料的降解速度快于新生组织的形成速度,因此其内部存在明显的空洞,与正常组织有较大的区别。对比与实验组和材料组,对照组的修复情况最差,染色结果显示,填充缺损部位的新生组织大部分为纤维软骨,组织结构和胞外基质分泌情况明显差于正常组织。ICRS大体及组织学评分结果显示实验组的修复情况与其他两组有显著性差异(P<0.05)。结论:(1)采用胶原酶消化的方法可以获得大量纯度较高、分化能力好的脂肪间充质干细胞,可以作为构建组织工程软骨的种子细胞。(2)利用脂肪间充质干细胞作为种子细胞与实验室自主研发的壳聚糖凝胶支架构建组织的工程软骨对缺损关节软骨具有良好的修复作用,且修复是一种完全的结构性的修复。