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在自然界中,光合作用是万物生长的能量来源,它能利用太阳能将无机物转变为有机物,为生物体代谢所使用。各种粮食作物的生产也离不开光合作用,只有充分提高光合能力,提升光合效率才能有效地增加粮食的产量,满足人类日益增长的需求。然而植物的光合作用受叶绿体发育和叶绿素合成等相关因素的影响,探索这些过程中相关基因的功能,有助于我们更好地利用光合作用,提高粮食产量。本实验室前期获得了一个水稻深绿穗dgp1(dark green panicle1)的突变体,该突变体的叶、穗都呈现出深绿表型,同时叶绿素含量增加,光合效率增强,并且已经通过图位克隆方法克隆到该基因。由于DGP1基因编码一个未知功能的蛋白,所以首先需要在水稻中筛选出与它互作的蛋白,并通过其互作蛋白的特性来深入研究该基因调控光合效率的机制。以水稻日本晴各个组织混合提取的RNA为材料,构建酵母双杂AD(PGADT7)载体上的cDNA文库。将DGP1基因构建到BD(PGBKT7)载体上,作为诱饵蛋白,它没有自激活现象。通过酵母双杂交的方法筛选DGP1的互作蛋白,发现了两个叶绿体发育相关的转录因子GOLDEN2-LIKE1(GLK1)和GOLDEN2-LIKE 2(GLK2)。克隆完整的GLK1、GLK2到酵母AD载体上,在酵母中一对一验证它们的编码蛋白与DGP1的互作。结果发现,共转AD-GLK1,BD-DGP1和AD-GLK2,BD-DGP1的酵母都在四缺板上可以正常生长出来并且显蓝,说明GLK1、GLK2与DGP1都存在互作关系。然后分别克隆GLK1、GLK2不同的GCT-box结构域,并以同样的方法在酵母中验证与DGP1的互作。结果发现,GLK1、GLK2不同的GCT-box结构域都可以与DGP1互作,并且相比于部分的GCT-box结构,完整的GCT-box结构更易于DGP1与GLK1、GLK2发生互作。利用原核表达分别得到融合蛋白GST:DGP1、His:GLK1和His:GLK2。由于在Pull-down实验中GST-DGP1可以下拉出His:GLK1和His:GLK2,所以实验结果进一步证实了 GLK1、GLK2与DGP1的互作关系。以原核表达得到的融合蛋白GST:DGP1和提取的水稻总蛋白为材料,通过Pull-down筛选水稻中与DGP1互作的其他蛋白,结果Pull-down实验下拉出两个蛋白条带,经过质谱测序分析后发现,它们分别是光合作用相关酶RuBisCO的大小亚基。然后分别构建RuBisCO大亚基和小亚基的酵母双杂载体,并在酵母中与DGP1进行一对一验证,结果只有一个小亚基RBCS5可以与DGP1互作,而其他的亚基均不与DGP1互作。然而本研究中酵母双杂筛选出的GLK1、GLK2没有在水稻总蛋白中被Pull-down下拉出来,这可能是由于水稻中GLK1、GLK2的蛋白丰度低且通过酵母双杂技术从水稻中筛选出的是它们C端部分的结构,完整的GLK1和GLK2与DGP1互作较弱。GLK1、GLK2是叶绿体发育相关的转录因子,它们调控叶绿体发育及光合相关基因的表达,而RuBisCO则是光合作用过程中的关键酶,对光合作用能力的增加及其光合效率的提升都至关重要。因此,DGP1可能通过GLK参与叶绿体的发育、叶绿素的合成,进而影响叶色和穗色,而与RuBisCO互作则调节RuBisCO的酶活性,直接影响光合作用。但是这些研究还需要后续大量的实验加以证实。