肠毒素大肠杆菌（ETEC）是引起新生仔猪和断奶仔猪腹泻的主要致病性大肠杆菌。本研究建立了猪源肠毒素大肠杆菌常见的菌毛基因型K88、K99、987P、F41和F18及其亚型的PCR分型检测方法，调查了湖北省内规模化猪场进行了ETEC菌毛基因型的分布特征，确定了K88和F18是引起断奶仔猪腹泻的ETEC两种最常见菌毛蛋白基因型。利用基因工程技术构建了表达K88ac菌毛亚单位基因faeG和F18ac菌毛亚单位基因fedF的融合基因faeG-linker-fedF的重组质粒，实现了faeG和融合基因faeG-linker-fedF在大肠杆菌中的表达，并探讨了重组的菌毛蛋白的免疫原性及其诱导产生卵黄抗体的作用，通过体外试验和动物试验评价由重组菌毛蛋白免疫制备的卵黄抗体在预防和控制断奶仔猪腹泻的潜在应用价值，进一步研究了卵黄抗体在断奶仔猪日粮中应用。结果如下：1．以ETEC标准菌株为试验材料，建立了ETEC K88、K99、987P、F41、F18及其变异体的PCR鉴定方法，并对湖北省部分地区规模化万头猪场进行了ETEC流行病学调查。结果表明：通过设计特异性引物，经PCR扩增出对应的目的片段。对2002-2003年来源于新生仔猪和断奶仔猪的227份腹泻粪样进行了K88及其变异体和K99的PCR检测，结果显示，23份（10.1％）被确定为含有ETEC K88，其变异体均为K88ac；13份含有K99（5.7％）。对2004年179份来源于1d至6w仔猪的腹泻粪样进行了ETEC K88、K99、987P、F41、F18及其变异体的PCR检测，共有60份（33.52％）含有ETEC菌毛基因型的一种或几种。其中，36份含有K88菌，占60.00％，是最主要的一种菌毛基因型；K88进一步的分型鉴定结果则显示，4份检出为K88ac（11.11％），32份为K88ad（88.89％），未检测出K88ab。含F18的样品数有16份，占26.67％；进一步的分型结果显示F18ab 5份（8.33％），F18ac 11份（18.34％）。另外，含K99菌的有2份（3.33％），987P有11份（18.33％），F41有3份（5.00％）。本试验结果表明，PCR方法鉴定ETEC具有快速、特异性强、敏感性和准确性高的优点，适合于大规模的流行病学调查；K88和F18是湖北地区新生仔猪和断奶腹泻粪样中最常见的两类菌毛基因型。2．通过PCR扩增技术，用疏水性连接肽（Gly₄Ser）3序列连接faeG和fedF两基因片段，构成融合基因faeG-linker-fedF，并分别构建faeG和faeG-linker-fedF的重组表达质粒。测序结果表明重组质粒中目的片段的DNA序列正确，将该重组表达质粒导入E．Coli DH5a和BL21（DE3）中诱导表达，结果faeG和faeG-linker-fedF在大肠杆菌中均获得高效表达，它在BL21（DE3）中的表达量均占总蛋白含量的30％左右，表达产物以包涵体的形式存在。3．采用响应面分析方法，对肠毒素大肠杆菌K88黏附素亚单位重组蛋白FaeG诱导表达的主要影响因素进行了优化研究。响应面分析结果表明：不同的诱导时机、IPTG浓度及诱导时间对目的蛋白表达量均有显著影响（P＜0.01），而三因素之间的交互作用对目的蛋白表达量也有极显著的影响（P＜0.01）。通过进一步的模拟优化，得到了最佳诱导表达条件为：培养BL21（K88ac）重组菌株2.5h后，加入IPTG至终浓度0.8mmol／L，37℃诱导培养5h。采用以上参数进行验证实验，得到目的蛋白在全菌蛋白中的表达含量为35.4％；与单次单因子法得到的最佳表达条件下的表达量（27.5％）相比，提高了28.7个百分点。本试验结果表明，采用响应面分析法可以确定IPTG的诱导时机、诱导浓度及诱导时间等多个因素对重组蛋白在大肠杆菌中表达的最佳作用条件，有利于提高目的蛋白的表达量。4．应用免疫印迹技术检测重组蛋白rFaeG和FaeG-FedF的免疫原性，结果发现rFaeG和FaeG-FedF均能够与兔抗K88ac阳性血清抗体发生特异性抗原抗体结合反应，FaeG-FedF还能够与F18“a”因子血清发生特异性抗原抗体反应，这表明重组蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF具有与天然菌毛蛋白相同或相似的抗原性。将重组蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF免疫蛋鸡，结果发现两种重组蛋白均能刺激蛋鸡产生免疫应答反应，并诱导卵黄抗体产生，在二免1周卵黄中的抗体水平便明显升高，平均效价可达1∶2¹⁰以上，且此抗体水平可以维持较长一段时间。因此，重组蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF可以作为卵黄抗体生产的候选免疫原。5．用分离提纯的K88ac菌毛蛋白、重组蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF免疫28周龄左右海兰褐开产蛋鸡，并收集鸡蛋将其喷雾干燥成粉，分别为Anti-K88ac SDEP，Anti-rFaeG SDEP和Anti-FaeG-FedF SDEP。利用体外试验研究了重组蛋白rFaeG和FaeG-FedF免疫获得的卵黄抗体抑制细菌黏附作用，结果显示：无抗体的对照组平均每个上皮细胞黏附7.6个K88ac；由提纯蛋白免疫获得的Anti-K88ac SDEP以及Anti-rFaeG SDEP和Anti-FaeG-FedF SDEP较对照组均极显著抑制了K88ac对肠上皮细胞的黏附作用，平均每个上皮细胞分别仅黏附1.0、1.2和1.0个细菌（P＜0.01）。3种卵黄抗体粉对细菌黏附肠上皮细胞均具有显著抑制作用，且三者的作用效果无明显差异（P＞0.05）。此外，与F18ac对照组相比，经Anti-FaeG-FedF SDEP处理后的F18ac黏附于肠上皮细胞上的数量极显著减少（P＜0.01）；同样经Anti-FaeG-FedF SDEP处理后的F18ab对肠上皮细胞的黏附也明显低于F18ab对照组（P＜0.01）。由此表明，由重组菌毛蛋白rFaeG和Fae-FedF制备的卵黄抗体均可以有效抑制K88ac对仔猪肠上皮细胞的黏附；此外，具备两种菌毛基因型的融合蛋白FaeG-FedF免疫获得的卵黄抗体，不仅可以抑制同源菌株F18ac的黏附作用，还可以阻断异源菌株F18ab对肠上皮细胞的黏附。6．通过三次饲养试验分别研究了重组蛋白免疫制备的卵黄抗体预防断奶仔猪腹泻的效果及其在断奶仔猪日粮中的应用。试验一选择了21±2d断奶仔猪140头，随机分成5组，其中对照组20头，日粮中分别添加普通全蛋粉，由提纯的K88ac菌毛蛋白、rFaeG包涵体和复性的rFaeG重组蛋白免疫制备的高免全蛋粉成为4个处理组，每个处理组3个重复栏，10头／栏。研究了rFaeG重组蛋白免疫制备的卵黄抗体预防断奶腹泻的效果，结果显示：仔猪断奶后0-28d，日粮中添加提纯的K88ac菌毛蛋白和复性的rFaeG重组蛋白免疫制备的高免全蛋粉，均能显著降低腹泻率（P＜0.05）和腹泻指数（P＜0.05），提纯菌毛蛋白组和重组蛋白组预防仔猪腹泻的作用效果没有显著差异。rFaeG包涵体免疫制备的高免全蛋粉预防仔猪腹泻的作用并不明显。试验全期各组的日增重、采食量、饲料转化率等差异不显著。与提纯菌毛蛋白的免疫获得的卵黄抗体相比，复性后重组蛋白免疫获得的卵黄抗体对预防仔猪腹泻具有一致的效果。因此，复性后的重组蛋白可以作为免疫原应用于卵黄抗体生产中。试验二选择选择21±3d断奶仔猪120头，随机分成3组，每组8个重复栏，5头／栏。以添加3％血浆蛋白粉日粮为正对照组，分别添加1％和1.5％复性rFaeG重组蛋白免疫制备的高免全蛋粉替代一半血浆蛋白粉的日粮为两个处理组。研究了rFaeG重组蛋白免疫制备的高免全蛋粉部分替代日粮中的血浆蛋白粉，对仔猪腹泻及生长性能的影响，并探讨在日粮中高免全蛋粉的适宜添加量。结果表明，试验全期，日粮添加高免全蛋粉的两组腹泻率显著低于对照组（P＜0.05），且腹泻指数明显较低（P＜0.01）。试验全期高免全蛋粉组与对照组仔猪49d平均体重均达到15kg以上，平均日增重无显著差异（P＞0.05），表现出一致的较好的生长速度。此外，尽管高免全蛋粉两组添加了不同比例的高免全蛋粉（1％vs 1.5％），但两组仔猪的腹泻率、腹泻指数、平均日增重、采食量以及料肉比均无显著差异。以上结果表明，日粮中用复性重组蛋白免疫制备的高免全蛋粉替代一半的血浆蛋白粉，可以获得与添加血浆蛋白粉一致甚至更好的控制腹泻和促生长效果；考虑成本，高免全蛋粉添加量以1％为宜。试验三选择360头24±3d断奶仔猪，随机分为5组，每组6个重复栏，12头／栏，主要研究重组蛋白rFaeG以及融合蛋白FaeG-FedF免疫获得的喷雾干燥全蛋粉，添加于氨基酸平衡的断奶仔猪日粮中对仔猪腹泻及生长性能的影响。以添加3％血浆蛋白粉的日粮为正对照，添加普通全蛋粉的日粮为负对照，分别添加由提纯的K88ac菌毛蛋白、复性的rFaeG重组蛋白和FaeG-FedF融合蛋白免疫制备的高免全蛋粉的日粮为各处理组。试验结果显示，断奶后1-2周，日粮中添加了提纯的K88ac菌毛蛋白、复性的rFaeG重组蛋白和FaeG-FedF融合蛋白免疫制备的高免全蛋粉组的腹泻率显著低于添加普通全蛋粉的负对照组（P＜0.05），与添加血浆蛋白粉的正对照组相比差异不显著。不同日粮处理组的仔猪腹泻指数也存在显著差异（P＜0.05），日粮中添加血浆蛋白粉和含特异性卵黄抗体的高免全蛋粉可以减轻断奶仔猪的腹泻程度。本试验中所有日粮处理组均表现出较好的生长速度，仔猪49d左右平均体重均能达到15kg以上，但各组之间不存在显著差异（P＞0.05）。在试验全期，日粮中添加血浆蛋白粉、提纯的K88ac菌毛蛋白和FaeG-FedF融合蛋白免疫制备的高免全蛋粉组的料肉比均显著低于普通全蛋粉组（P＜0.05）。本试验各阶段，各组的采食量均未出现显著性差异。以上结果表明在氨基酸平衡日粮中添加Anti-K88 SDEP和Anti-FaeG-FedFSDEP，与血浆蛋白粉一样，具有良好的促进断奶仔猪生长，提高饲料转化率的作用。综上所述，重组ETEC菌毛蛋白可以作为免疫原应用于卵黄抗体生产中，其制备的卵黄抗体添加于仔猪日粮中是预防断奶仔猪ETEC性腹泻的有效途径之一。