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目的:糖代谢在肾癌细胞中参与多种生命活动,与肿瘤细胞的免疫逃逸有关,但其机制尚未明确。本研究通过模拟癌细胞低糖微环境降低糖酵解水平,探索癌细胞糖代谢重编程与免疫检查点PD-L1的关系,并探讨其相关分子作用机制对免疫逃逸的影响。方法:根据不同的干预条件来对786-O和OS-RC-2细胞进行分组,以干预培养不同的糖浓度梯度将其分为对照组(2000mg/L)、低糖组(786-O:500mg/L,OS-RC-2:125mg/L);通过qRT-PCR和Western Blot(WB)来测定低糖环境中免疫逃逸相关分子PD-L1在mRNA和蛋白水平的表达。通过WB法来测定糖酵解相关分子HIF-1α,PFKFB3,LDHA以及EGFR/ERK/c-Jun通路蛋白的表达情况。分别应用HIF-1α抑制剂(PX-478)和PFKFB3的抑制剂(PFK-015)后WB方法检测糖酵解相关蛋白HIF-1α,PFKFB3,LDHA的上下游关系以及与PD-L1的关系,同时测乳酸(LD)水平对比糖酵解水平变化。通过加入EGFR抑制剂(Gefitinib)、EGFR激活剂(EGF)、ERK抑制剂(U0126)、c-Jun抑制剂(SP600125),后用WB方法检测EGFR、ERK、c-Jun、PD-L1,确定相关分子上下游关系及对PD-L1表达的影响。共培养CD3淋巴细胞和糖酵解抑制剂干预后的肾癌细胞后用IFN-γ试剂盒检测IFN-γ水平,确定糖酵解对PD-L1介导的免疫逃逸的影响;应用PD-L1的小干扰RNA(SiRNA)敲低PD-L1表达后WB检测糖酵解关键酶的表达,验证PD-L1对糖酵解代谢是否有影响。通过MTT法和活细胞工作站分别检测不同组别786-O和OS-RC-2细胞增殖能力。结果:1.RT-qPCR和WB结果显示与正常糖浓度比较,两种细胞的低糖干预组PD-L1表达均上调;WB结果显示低糖组糖酵相关酶HIF-1α,PFKFB3和LDHA均上调,且糖浓度越低,其表达水平越高。2.加入HIF-1α抑制剂(PX-478)后,HIF-1α、PFKFB3、LDHA下调,LD下调,PD-L1上调;加入PFKFB3(U0126)抑制剂后,PFKFB3、LDHA下调,PD-L1上调;证明HIF-1α是调控PFKFB3和LDHA的上游分子,PFKFB3是调控LDHA的上游分子,LD水平降低提示糖酵解水平下降。3.加入EGFR抑制剂(Gefitinib)后p-EGFR、p-ERK、p-c-Jun、PD-L1下调,加入EGFR激动剂(EGF)后p-EGFR、p-ERK、p-c-Jun、PD-L1上调;加入ERK抑制剂(U0126)后,p-ERK、p-c-Jun、PD-L1下调,加入c-Jun抑制剂(SP600125)后,p-c-Jun、PD-L1下调,确定EGFR/ERK/c-Jun通路调节PD-L1。4.通过IFN-γ检测发现加入HIF-1α抑制剂组和PFKFB3抑制剂组,IFN-γ水平低,证明抑制糖酵解使PD-L1上调导致CD3淋巴细胞分泌IFN-γ降低。5.通过SiRNA敲低PD-L1的表达后,WB检测发现,PFKFB3下调,HIF-1α无明显变化,表明PD-L1通过PFKFB3调节糖酵解。6.活细胞工作站和MTT法均表明低糖或抑制糖酵解关键酶导致细胞增殖受到抑制。结论:本研究阐明了肾癌细胞系786-O和OS-RC-2进行糖酵解对PD-L1表达的影响及机制,在一定范围内细胞微环境中葡萄糖浓度越低,肿瘤细胞PD-L1表达水平越高;环境低糖或抑制糖酵解关键酶都会导致糖酵解水平降低,PD-L1上调,其机制通过激活EGFR/ERK/c-Jun通路上调PD-L1,导致淋巴细胞表达IFN-γ能力降低,进而发生免疫逃逸;同时PD-L1又通过PFKFB3反馈性调节糖酵解,避免糖酵解产能过渡;抑制糖酵解水平对细胞增殖有明显抑制作用。