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类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是累及关节滑膜的慢性自身免疫性疾病，在我国的患病率约为0.4%，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现。目前的研究显示RA与T细胞功能异常介导的自身免疫损伤密切相关，过度活化的T淋巴细胞也是RA免疫病理进程中的重要环节。T细胞活化需要双信号：第一信号由T细胞受体（TCR）识别抗原提呈细胞（APC）表面的抗原肽-MHC复合物(p-MHC)启动；第二信号由T细胞和APC间协同刺激分子的相互作用启动，B7/CD28是其中最重要的一对协同刺激分子。近几年，B7/CD28家族成员不断扩大，PD-1（Programmed death-1）是一个新近发现的协同刺激分子，由PDCD1基因编码。一系列研究表明，PD-1通过与其两个配体PD-L1和PD-L2作用而抑制T、B细胞的活化及细胞因子的产生，在维持机体免疫耐受上发挥至关重要的作用。同时，PD-1分子也与一系列疾病的免疫病理发生发展密切相关。因此，PD-1分子成为近年来免疫学研究的热点，有望成为肿瘤、自身免疫性疾病和病毒感染性疾病的免疫干预治疗的有效靶分子。本课题拟通过检测RA患者与骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）患者，健康对照（Healthy Controls,HC）外周血可溶性PD-1（soluble PD-1,sPD-1）的表达，结合RA患者临床分期、临床症状、实验室指标，探讨sPD-1在RA患者中的表达及其功能，通过分析RA患者外周血IFN-γ、IL-4、IL-17A等细胞因子的表达和不同SNP基因型患者sPD-1表达的差异，探讨sPD-1在RA患者中异常表达的分子机制。第一部分可溶性PD-1在类风湿性关节炎患者中的表达及其功能的初步研究目的：研究可溶性PD-1分子（soluble PD-1，sPD-1）在类风湿性关节炎患者中的表达和临床意义，初步研究sPD-1对PD-1/PD-L1信号通路的影响。方法：通过本实验室前期研制的sPD-1分子ELISA检测试剂盒检测sPD-1在RA患者外周血中的表达，分析sPD-1与RA患者临床分期、临床症状、实验室指标的相关性；流式细胞术（FCM）检测RA患者外周血CD4+T细胞上膜型PD-1（mPD-1）的表达；使用Real Time PCR检测flPD-1、PD-1Δex3，从mRNA水平验证mPD-1和sPD-1在RA患者中的表达；通过CCK8检测细胞增殖的方法研究sPD-1对CD4+T细胞体外增殖的影响。结果：①RA患者外周血sPD-1的含量为38.39±5.45ng/ml，显著高于HC(20.56±1.29ng/ml，P=0.0003)和OA(21.88±2.35ng/ml，P=0.0493)，急性活动期患者sPD-1的表达显著高于慢性缓解期(P=0.0027)；②RF阳性RA患者sPD-1的表达明显高于RF阴性患者(P=0.0491)，sPD-1与RF滴度、关节肿胀数呈正相关(r=0.2668，P=0.0411；r=0.4365，P=0.0003)；③急性活动期RA患者外周血CD4+T细胞mPD-1的表达明显高于HC(P <0.001)和OA(P <0.001)；④mRNA水平RA患者PD-1Δex3的表达明显高于HC(P=0.0346)和OA(P=0.0401)，与ELISA结果一致，flPD-1的表达高于HC(P=0.0057)和OA(P=0.0457)，与FCM的结果一致；⑤PD-L1对CD4+T细胞的体外增殖具有显著的抑制作用，而这种抑制作用可被sPD-1逆转(P=0.0035)。结论：RA患者外周血sPD-1明显上调，并与临床分期、临床症状和预后相关，sPD-1可干预PD-1/PD-L1信号通路，在RA的免疫病理进程中发挥重要作用。第二部分可溶性PD-1在类风湿性关节炎患者中异常表达的分子机制的初步研究第一节RA患者外周血细胞因子的表达及与PD-1Δex3的相关性目的：研究T细胞亚群分泌的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A、IL-21在RA患者中的表达，PD-1Δex3与RA患者失衡的细胞因子的相关性。方法：ELISA检测T细胞体外活化各时相IFN-γ、IL-4、IL-10的变化，RealTimePCR检测静息状态下mRNA水平IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A、IL-21在RA患者PBMC中的表达，并结合RA患者PD-1Δex3的表达做相关性分析。结果：①IFN-γ、IL-4、IL-10在T细胞体外活化各时相的表达呈上升趋势；②RA患者IFN-γmRNA水平的表达明显高于HC(P=0.0421)，与OA无明显差异(P=0.1637)，IFN-γ与PD-1Δex3的表达具有明显的正相关性(r=0.4633，P=0.0026)；③RA患者IL-4mRNA水平的表达明显高于HC(P=0.0359)和OA(P=0.0499)，与PD-1Δex3的表达具有明显的正相关性(r=0.4109，P=0.0069)；④RA患者IL-10mRNA水平的表达与HC(P=0.4104)和OA(P=0.2267)无明显差异，IL-10与PD-1Δex3的表达具有正相关性(r=0.4374，P=0.0048)；⑤RA患者IL-17A mRNA水平的表达明显高于HC(P=0.0420)和OA(P=0.0428)，IL-17A与PD-1Δex3的表达具有明显的正相关性(r=0.4065，P=0.0092)；⑥RA患者IL-21的表达明显高于HC组(P=0.0425)，但与OA组无明显差异(P=0.0702)，与PD-1Δex3的表达无明显相关性(r=0.1761，P=0.2471)。结论：T细胞亚群的异常活化，相关炎性细胞因子的上调可能与sPD-1的产生有关，为进一步研究T细胞亚群在RA免疫病理进程中的作用，以及对sPD-1的调控提供新的思路。第二节PDCD1基因多态性与sPD-1的表达目的：寻找RA患者内含子2-外显子3-内含子3序列的SNP位点，研究选择性剪接异构体PD-1Δex3的产生与RA患者遗传背景的关系。方法：通过PCR-直接测序的方法扫描PDCD1基因内含子2-外显子3-内含子2序列，筛查该序列内中国人群特异性SNP位点；对中国人群RA患者和健康对照候选SNP位点进行基因分型，分析SNP位点与RA的相关性；将SNP的基因分型结果与RA患者sPD-1的表达进行综合分析。结果：①发现目标序列上存在3个SNP位点，其中SNP2和SNP3为新发现位点，生物信息学软件预测这3个SNP位点分别位于剪接因子SRp40、SC35和SF2/ASF的结合靶点内；②SNP1（rs34819629）G等位基因在RA病人组中的分布频率明显大于正常对照组（P=0.021），基因型频率分布在RA病例和对照组之间的分布有显著性差异（P=0.037），最佳遗传模式为加性；③SNP1G/G和A/G基因型RA患者sPD-1的表达明显高于A/A基因型RA患者（P=0.0237，P=0.0488）。结论：本实验对PDCD1基因SNP1和sPD-1蛋白表达的关系进行初步探究，结果提示sPD-1参与了RA的免疫耐受，其病理状态下的异常高表达可能是由于外显子3两侧存在的SNP影响了PD-1mRNA的选择性剪接，而其中具体的分子机制需要进一步的研究。