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目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是最常见的痴呆症类型,随着老龄化进程的加快,世界范围内每年新增的AD病患迅速地成为一个不可小觑的数字。AD的临床主要表现为记忆力减退、认知和行为障碍、学习思维障碍以及人格改变等,AD的神经病理学特征主要表现为在新皮质和灰质中由过度磷酸化的tau形成神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)和由0淀粉样蛋白(amyloid-beta,Aβ)异常沉积而形成的老年斑(senile plaques,SPs)。而随着研究的深入,研究者认为除了经典的神经细胞损伤外,白质变性和脱髓鞘也是AD不可忽视的病理学表现。少突胶质细胞的分化,髓鞘形成和髓鞘再生的过程被多个相互协调的信号转导途径严格调节,PI3K/Akt-mTOR通路就是其中之一。参枝苓口服液是我国第一个经国家食品药品监督管理局批准用于治疗AD的中药复方新药,以中医“心主神明”理论立方,在孙思邈《备急千金要方》中开心散的基础上加以衍生,对AD有着肯定的疗效,但参枝苓口服液对AD早期少突胶质细胞以及髓鞘的结构与功能的影响却知之甚少。本研究旨在利用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)损伤大鼠少突胶质OLN-93细胞,建立一种体外拟AD细胞模型,并以PI3K/Akt-mTOR信号通路为靶点,研究参枝苓口服液对少突胶质细胞和髓鞘的保护作用,为临床运用参枝苓口服液治疗AD提供进一步的依据。方法1.40只雄性SD成年大鼠(200±20g)随机分为正常组(n=10)和参枝苓口服液组(n=30),参枝苓口服液组以成人(70kg)等效剂量的2倍量进行灌胃,正常组灌服等体积双蒸水,每日上午8时灌胃1次,连续灌胃7天,末次给药2h后,腹腔注射4%水合氯醛麻醉大鼠,腹主动脉取血,制备参枝苓口服液含药血清。2.采用超高效液相色谱-多反应监测-串联质谱(UHPLC-MRM-MS/MS)法,对参枝苓口服液含药血清中芍药苷、肉桂酸、芍药内酯苷、甘草苷、甘草酸5种指标成分进行定量分析。3.以STZ损伤少突胶质OLN-93细胞的方法建立体外拟AD模型;用HE染色、CCK-8/LDH漏出率检测、RT-PCR、流式细胞术实验方法评价模型。4.CCK-8法检测细胞活性,确定参枝苓口服液含药血清与多奈哌齐最佳剂量。5.将OLN-93细胞分为4组:①正常对照组:无血清DMEM+15%正常大鼠血清;②模型组:无血清DMEM+15%正常大鼠血清;③参枝苓口服液含药血清组:无血清DMEM+15%%参枝苓口服液含药血清;④多奈哌齐组:无血清DMEM+500nM多奈哌齐。6.Western blot和RT-PCR法检测参枝苓口服液含药血清对STZ损伤OLN-93细胞拟AD模型PI3K/Akt-mTOR通路及髓鞘相关蛋白的影响。7.应用PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂LY294002和mTOR特异性抑制剂Rapamycin,Western blot和RT-PCR法检测PI3K/Akt-mTOR通路阻断后参枝苓口服液含药血清对PI3K/Akt-mTOR通路及髓鞘相关蛋白的影响。8.染色质免疫共沉淀法研究组蛋白去乙酰化对少突胶质细胞基因表观调控的影响。9.液相质谱-色谱联用技术检测参枝苓口服液含药血清对STZ损伤OLN-93细胞拟AD模型中总脂肪酸含量的变化。结果1.UHPLC-MRM-MS/MS法检测参枝苓口服液含药血清,发现此次提取的参枝苓口服液含药血清中,均含有一定含量药物有效成分:芍药苷、肉桂酸、甘草苷、甘草酸,说明上述药物确实经过灌胃方式进入大鼠的胃肠道,通过肝肠循环、代谢,进入血液,从而发挥一定的作用。2.以1mM STZ损伤OLN-93细胞3h的方法建立体外拟AD细胞模型。CCK-8法检测到与正常组相比,模型组OD值明显降低(P<0.01);LDH漏出率检测模型组LDH漏出率明显升高(P<O.01);RT-PCR法检测到模型组IR、IRS1 mRNA转录水平显著降低(P<0.01);流式细胞术检测到模型组ROS表达水平显著升高(P<0.01)。3.CCK-8结果显示:1mMSTZ损伤OLN-93细胞3h后20%、15%的参枝苓口服液含药血清均能够提高细胞活性(P<0.05);10%参枝苓口服液含药血清组在16h～24h能提高细胞活性(P<0.05),48h后无统计学意义(P>0.05);5%参枝苓口服液含药血清组的细胞活性值无统计学意义(P>0.05)。11μM多奈哌齐作用16h时细胞活性无统计学意义(P>0.05),作用至24～48h时,细胞活性显著升高(P<0.01);500nM多奈哌齐能显著提高细胞活性(P<0.01);250nM组多奈哌齐在作用24h时明显升高细胞活性(P<0.01)。4.Western blot结果显示:模型组PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达比正常组明显减少(P<0.01)。与模型组相比,500nM的多奈哌齐与15%的参枝苓口服液含药血清均可显著提高PI3K、Akt、p-Akt的蛋白表达(P<0.01)。500nM的多奈哌齐可提高mTOR、p-mTOR蛋白表达(P<0.05);15%的参枝苓口服液含药血清可显著提高mTOR蛋白表达(P<O.01),提高p-mTOR蛋白表达(P<0.05)。同时模型组的MBP、MOG、PLP蛋白表达显著减少(P<0.01)。与模型组相比,15%的参枝苓口服液含药血清可显著提高MBP和MOG蛋白表达(P<0.01),并提高PLP蛋白表达(P<0.05)。500nM的多奈哌齐可提高MBP蛋白表达(P<0.05)和MOG蛋白表达(P<0.01),并提高PLP蛋白表达趋势,但没有统计学意义(P>0.05)。5.RT-PCR结果显示,模型组Akt、p-Akt、mTOR mRNA转录显著减少(P<0.01)。与模型组相比,15%的参枝苓口服液含药血清可以提高Akt、P-Akt mRNA的转录水平(P<0.05);15%的参枝苓口服液含药血清和500nM的多奈哌齐均可明显提高mTOR mRNA转录水平(P<0.01);500nM多奈哌齐能显著提高Akt、p-Akt mRNA的转录水平(P<0.01)。同时,正常组能够正常转录MBP mRNA,与正常组相比,模型组的MBP mRNA转录显著减少(P<0.01)。与模型组相比,15%的参枝苓口服液含药血清和500nM的多奈哌齐均可明显提高MBP mRNA转录水平(P<0.01)。6.应用PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂LY294002和mTOR特异性抑制剂Rapamycin后,Western blot检测结果显示:模型组p-Akt、MBP蛋白表达显著减少(P<0.01);与模型组相比,模型+LY294002组p-Akt、MBP表达均显著减少(P<0.01);与模型组+LY294002组相比,15%的参枝苓口服液含药血清+LY294002和500nM多奈哌齐+LY294002均能够在PI3K/Akt通路阻断的背景下,显著提高p-Akt、MBP蛋白表达水平(P<0.01或P<0.05)。同时,与正常组相比,模型组的p-mTOR、MBP蛋白表达显著减少(P<0.01);与模型组相比,模型+Rapamycin组的p-mTOR、MBP表达均显著减少(P<0.01);与模型+Rapamycin组相比,15%的参枝苓口服液含药血清+Rapamycin组和500nM多奈哌齐+Rapamycin组均能够在mTOR通路阻断的背景下,提高p-mTOR、MBP蛋白表达水平(P<0.05)。7.应用PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂LY294002和mTOR特异性抑制剂Rapamycin后,RT-PCR的结果显示:模型组MBP mRNA转录显著减少(P<0.01);与模型组相比,模型+LY294002组、模型+Rapamycin组的MBP mRNA转录显著减少(P<0.01)。与模型+LY294002组相比,15%的参枝苓口服液含药血清+LY294002组和500nM多奈哌齐+LY294002组均能够在LY294002阻断PI3K/Akt通路的背景下,显著提高MBP mRNA转录水平(P<0.01);与模型+Rapamycin组相比,15%的参枝苓口服液含药血清+Rapamycin组和500nM多奈哌齐+Rapamycin组均能够在mTOR通路阻断的背景下,显著提高MBP mRNA的转录水平(P<0.01)。8.ChIP检测显示:模型组OLN-93细胞olig2启动子序列HDAC2去乙酰化水平明显升高(P<0.01),15%参枝苓口服液含药血清与500nM多奈哌齐均能显著降低HDAC2去乙酰化水平(P<0.01)。9.液相质谱-色谱联用检测显示:与正常组相比,模型组内的饱和脂肪酸月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸、十九酸、反式二十碳烯酸、二十二碳烯酸、花生四烯酸、山嵛酸、巴西烯酸、二十二碳六烯酸、木蜡酸、神经酸的含量都显著降低(P<0.01);棕榈油酸、顺式-9-油酸、异油酸、顺式-9,12-亚油酸、顺式-11,14-二十碳二烯酸、顺式-11,14,17-二十碳三烯酸、二十碳五烯酸、芥子酸的含量都显著升高(P<0.01);其余脂肪酸的含量无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,15%的参枝苓口服液含药血清能够升高月桂酸、硬脂酸、α-亚麻酸、反式二十碳烯酸、二十二碳烯酸、花生四烯酸、巴西烯酸的含量(P<0.01或P<0.05);降低棕榈油酸、异油酸、顺式-9,12-亚油酸、十九酸、顺式-11,14,17-二十碳三烯酸、二十碳五烯酸的含量(P<0.01或P<0.05);500nM的多奈哌齐能够升高肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、顺式-9-油酸、二十二碳烯酸、花生四烯酸、巴西烯酸的含量(P<0.01或P<0.05);降低顺式-9,12-亚油酸、异油酸、十九酸、二十碳五烯酸的含量(P<0.01或P<0.05)。结论参枝苓口服液能够通过改善PI3K/Akt-mTOR信号通路的活性,刺激Akt磷酸化,增加PI3K/Akt蛋白及基因表达,调控下游mTOR的蛋白及基因表达,发挥髓鞘保护作用,并可能通过改善脂肪酸代谢紊乱状态的途径,维持髓鞘的稳定性。同时我们推测,参枝苓口服液还能够通过降低HDAC2的去乙酰化水平,来提高oloig2基因表达,在表观遗传学上发挥其髓鞘保护作用。