牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一种重要的海水经济鱼类,雌性个体较雄性个体生长快,在生产上雌鱼饲养周期较短,因而具有很高的经济价值。性别分化与性腺发育一直是鱼类发育和繁殖生物学研究的重要方向。近年来,越来越多的研究表明miRNA在脊椎动物发育和生殖中发挥重要作用。我们在先前的研究中意外发现色素框同源物2(chromobox homolog 2,CBX2)是牙鲆雌雄性腺差异表达的miR-200家族作用的潜在靶基因。CBX2是多梳蛋白(Polycomb group complex,PcG)家族的关键成员之一,它作为重要的转录因子在哺乳动物的性发育中发挥着关键作用。如果该基因突变或功能缺失将导致性反转,但关于CBX2在除哺乳动物外的其他脊椎动物性别分化与性腺发育中的功能,至今尚不清楚。因而本研究在牙鲆中鉴定了cbx2基因,并采用多种分子生物学技术分析了其表达谱以及其与miR-200家族与多个性别相关基因的作用关系,为揭示miRNA通过调节cbx2基因表达而参与牙鲆性腺发育的分子机制奠定基础。本研究利用分子克隆技术克隆了牙鲆cbx2基因的cDNA序列,该cDNA序列含有1 584bp的开放阅读框,编码527个氨基酸;运用生物信息学方法分析牙鲆CBX2蛋白质的理化性质与空间结构,结果显示蛋白质分子量和等电点分别为56578.98和10.03,是一种亲水性蛋白,且偏碱性,该蛋白无信号肽,无跨膜区域,且编码该蛋白的氨基酸中以丝氨酸(Sr)的含量为最高;其二级结构中含有1个染色质结构域和4个低复杂结构域,该染色质结构域常结合甲基化氨基酸残基;空间结构分析发现,牙鲆CBX2蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主;并比较了脊椎动物中cbx2的基因结构、氨基酸同源性、系统进化,表明cbx2基因在脊椎动物进化中较为保守,牙鲆cbx2与尼罗罗非鱼与青鳉的基因结构更为相似,其氨基酸同源性与杜氏鰤(Seriola dumerili)最高,为89%。本研究运用实时荧光定量PCR技术构建了牙鲆cbx2基因在性腺发育时期与成鱼的各个组织的时空表达谱,结果显示cbx2基因在牙鲆精巢中的表达量最高,卵巢次之,而在其他组织中的表达较低,与RT-PCR结果相似。cbx2基因在牙鲆未受精卵和早期胚胎发育中有一定的母源性表达,至神经胚期表达量达到最高,出膜之后表达量则降到较低的水平;运用免疫组织化学检测CBX2蛋白在精卵巢组织中的定位,结果发现CBX2在II、III和IV期精巢组织中均有表达,其中在III期的初级和次级精母细胞中具有较强的免疫信号,而在V期的精子中则几乎检测不到CBX2蛋白的表达,同时检测了CBX2蛋白在II期到V期卵巢的表达,发现CBX2蛋白主要在II期和III期卵巢组织中表达,但同时期总体上其在精巢中的表达高于卵巢中表达,此结果与定量结果也较为相似。这些结果表明cbx2基因可能参与了性腺中生殖细胞的增殖和减数分裂。为探讨cbx2与性别相关基因的相关性,本研究利用实时荧光定量PCR技术检测了cbx2与4个已知性别相关基因(sf1、sox9、foxl2和wnt4)在牙鲆雌雄性腺中的表达,结果发现cbx2、sf1、sox9在精巢中的表达显著高于卵巢,而foxl2和wnt4在卵巢中的表达较高。本研究还运用RNAi干扰技术在牙鲆胚胎细胞中对cbx2基因进行干扰,筛选出了cbx2-siRNA的最佳干扰序列和干扰时间,并利用荧光定量PCR技术检测了RNAi干扰后cbx2及sf1、sox9、foxl2和wnt4的表达变化。结果显示cbx2的表达明显被抑制,精巢发育关键因子sf1、sox9被同向抑制,而其反向表达的卵巢发育关键因子foxl2和wnt4的表达则明显上调。最后,为证实cbx2基因与miRNA间的作用关系,本研究利用双荧光素酶报告基因技术研究了miRNA-200家族基因与cbx2间的靶向关系,实验表明牙鲆cbx2是miR-200家族中pol-miR-200a和pol-miR-200b直接调节的靶基因,而该家族中pol-miR-429和pol-miR-141对牙鲆cbx2基因表达无明显的调节作用,表明pol-miR-200a和pol-miR-200b可能通过直接调节cbx2基因表达而参与牙鲆性腺发育的过程。综上所述,本论文为深入研究miRNA-cbx2-性别相关基因在牙鲆性腺发育中的作用奠定了重要基础。