微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,能够感染从无脊椎动物到脊椎动物几乎所有的真核生物,包括重要的经济动物,如对虾、家蚕、鱼等,以及人类。在桑蚕养殖上微粒子病和带毒蚕种每年都会给我国蚕业生产造成高达上千万元的经济损失,因此如何攻克微粒子病就成了蚕业科学研究的重点。在发现微孢子虫可以感染脊椎动物甚至人类后,人们越来越重视对它的研究。随着多种微孢子虫基因组序列的公布,微孢子虫研究也进入了功能基因组时代。　　 家蚕微孢子虫(Nosemabombycis)是Nosema属的代表种,也是最早被发现的微孢子虫。本实验室完成了家蚕微孢子虫基因组测序,注释出了4400多个基因,比较基因组分析发现家蚕微孢子虫具有19个丝氨酸蛋白酶抑制物(serpin)基因,其中氨基酸序列大于200的有15个,并且serpin基因只存在于Nosema属的微孢子虫中。目前对家蚕微孢子虫这些serpin所起的作用还知之甚少。　　 Serpin是一类具有Serpin结构域蛋白的统称,在生物代谢中它们起着蛋白酶抑制剂、能量转运、蛋白质存贮等作用,在生物体的代谢中具有举足轻重的作用。在本研究中,为了探索家蚕微孢子虫serpin基因产物的定位特征及研究家蚕微孢子虫serpin蛋白发挥功能的部位,我们对NbSPN13进行了序列与转录分析及基因表达、抗体制备、酿酒酵母亚细胞定位等实验,主要结果如下:　　 1.NbSPN13基因序列特征与转录分析　　 我们通过家蚕微孢子虫基因组数据库获得了serpin基因NbSPN13全序列,在对其进行分析后发现,NbSPN13蛋白氨基酸序列具有6个N-糖基化位点,同时没有O-糖基化位点和GPI锚定位点的存在,另具有5个半胱氨酸残基,这暗示着在NbSPN13蛋白在合成过程中可能有N-糖基化的修饰及二硫键的生成。同时在家蚕微孢子虫serpin基因NbSPN4,NbSPN13,NbSPN18,NbSPN19氨基酸序列多重序列比对结果中发现这四个基因的信号肽序列具有90%以上的相似性。为了研究它们信号肽在蛋白定位中的靶向位置,我们将NbSPN13的信号肽序列与部分细胞器定位特征序列进行比对,发现该基因的信号肽部分与内质网和线粒体定位特征序列在组成氨基酸的极性特征上有35%-40%的相似性;同时,我们对该蛋白进行了亚细胞定位预测,结果显示该蛋白具有内质网和线粒体的定位特征。为了验证该基因的转录特征,我们收集了感染家蚕微孢子虫不同时期的家蚕中肠组织,并提取中肠总RNA,对NbSPN13基因进行了转录分析,发现该基因在感染家蚕后的第一天到第十天都有转录。　　 2.NbSPN13基因的原核表达及多克隆抗体制备　　 我们将缺少信号肽部分的基因序列△NbSPN13构建到pGEX载体上,经过转化表达菌株,并诱导该基因表达后得到GST-ANbSPN13融合蛋白,经检测该蛋白以包涵体形式存在。我们对该蛋白进行切胶纯化,并免疫注射小鼠获得了针对NbSPN13蛋白的多克隆抗体,经过琼脂糖扩散试验检测,抗血清在稀释32倍时仍然能产生沉淀线,说明我们的抗血清能满足后续的实验要求。我们用家蚕微孢子虫孢子总蛋白与针对NbSPN13蛋白的抗体进行Westemblotting分析,发现两条带,而且蛋白条带所处分子量比预期的偏大。我们推测NbSPN13蛋白在成熟孢子中检测条带偏大的原因可能是存在不同种类或者不同程度的修饰作用。　　 3.NbSPN13蛋白的定位分析　　 为了分析NbSPN13蛋白的表达定位特征,我们选择模式生物酿酒酵母作为宿主菌来对NbSPN13基因的表达产物进行亚细胞定位研究。构建pUG35-NbSPN13和pUGG35-ANbSPN13载体将目的基因与GFP形成融合蛋白基因(NbSPN13-GFP和△NbSPN13-GFP)后,转化酿酒酵母,经诱导培养后观察荧光定位情况,我们发现NbSPN13蛋白的信号肽具有将融合蛋白定位到酿酒酵母线粒体的作用。已有报道,人类的SERPIN蛋白可以定位于线粒体,与癌细胞的凋亡相关。同时我们利用NbSPN13蛋白的抗体对家蚕微孢子虫进行间接免疫荧光定位,实验结果显示NbSPN13蛋白主要分布在孢子外周部位。本研究确认了NbSPN13蛋白的定位特征,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。