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脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)作为一种高发病率高致残率的疾病依靠目前治疗手段无法完全治愈且患者还将面临神经障碍。脊髓损伤后难以自我修复的主要原因在于:星形胶质细胞被活化为反应性星形胶质细胞分泌细胞外基质并形成瘢痕阻碍轴突生长;脊髓损伤区域扩大形成空洞使轴突难以跨越空洞与远端神经形成链接。近年来细胞移植成为治疗脊髓损伤的有效策略,其中雪旺细胞(Schwann cells,SCs)作为种子细胞能够填充空洞、引导轴突生长、提供营养以及再髓鞘化以促进神经修复。然而移植后的雪旺细胞与星形胶质细胞无法相容整合,雪旺细胞与星形胶质细胞在体内或体外条件下易形成边界难以向彼此区域迁移和交错生长;另一方面星形胶质细胞发生活化以及形成胶质瘢痕阻碍雪旺细胞进入周围脊髓组织,成为限制雪旺细胞治疗SCI的科学难题。研究表明,microRNA-124(miR-124)在中枢神经系统的神经元内特异性高表达,能够调控多种细胞向神经元分化,并调控上百个靶基因改变细胞特性。课题组前期研究中发现,星形胶质细胞过表达miR-124后转分化为神经元,GFAP表达下调活化受到抑制;应用qRT-PCR检测到雪旺细胞和星形胶质细胞中miR-124的表达均显著低于正常的脊髓组织。为达到改造雪旺细胞特性促进与星形胶质细胞整合,调控损伤微环境抑制星形胶质细胞反应性活化的目的,本研究拟应用miR-124改造雪旺细胞特性,促进二者相容整合,抑制星形胶质细胞活化减少瘢痕形成,促进SCI再生修复。本研究从大鼠提取原代雪旺细胞和星形胶质细胞,应用细胞免疫荧光鉴定细胞特性及纯度;通过携带miR-124基因的慢病毒载体导入雪旺细胞构建稳定过表达miR-124的雪旺细胞,应用RT-PCR、qRT-PCR、Western blot检测过表达miR-124对雪旺细胞标志物在基因及蛋白水平表达的影响,应用EdU和cck-8检测过表达miR-124对雪旺细胞增殖的影响;通过边界实验确定过表达miR-124的雪旺细胞与星形胶质细胞发生相容整合,应用Western blot检测相容整合相关分子EphA4、N-Cadherin、Krox20的表达;应用双荧光素酶实验检测Krox20是否为miR-124直接结合的靶基因;通过Transwell小室实验模拟雪旺细胞移植到脊髓的微环境,应用qRT-PCR、Western blot检测过表达miR-124的雪旺细胞对星形胶质细胞活化相关信号通路在基因和蛋白水平表达的影响。结果如下:(1)成功分离培养成体大鼠坐骨神经来源的雪旺细胞和乳鼠大脑皮层来源的星形胶质细胞,通过细胞免疫荧光鉴定雪旺细胞标志物GFAP、Sox10、p75NTR;星形胶质细胞标志物GFAP、S100β,均为强阳性表达,结果提示获得纯度较高的雪旺细胞和星形胶质细胞;(2)通过携带miR-124的慢病毒载体构建稳定过表达miR-124的雪旺细胞,通过qRT-PCR检测导入慢病毒48h、96h、7d后,雪旺细胞中miR-124表达量持续提高4倍左右;(3)过表达miR-124的雪旺细胞增殖无显著变化,其标志物GFAP和转录因子Sox10在基因水平表达下调,GFAP在蛋白水平表达下调,神经营养因子NT-3、BDNF在基因水平表达上调;(4)通过边界实验检测过表达miR-124的雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合能力增强,正常的雪旺细胞与星形胶质细胞在体外培养下形成边界;(5)应用Western blot检测过表达miR-124的雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合相关分子表达,其中EphA4、N-Cadherin无明显变化,Krox20表达显著下调;应用双荧光素酶实验检测到Krox20不是miR-124的靶基因,推测miR-124通过间接作用抑制Krox20表达促进细胞相容整合;(6)通过Transwell小室实验检测过表达miR-124的雪旺细胞对星形胶质细胞特性的影响。应用qRT-PCR检测星形胶质细胞标志物GFAP、Sox9、S100β表达无显著变化;应用Western blot检测星形胶质细胞活化相关分子GFAP表达下调,形成瘢痕相关信号通路STAT3磷酸化水平下降;综上所述,过表达miR-124对雪旺细胞增殖无影响,能够抑制雪旺细胞GFAP和Krox20在基因和蛋白水平的表达,使雪旺细胞倾向与星形胶质细胞发生整合,其机制可能是miR-124间接作用于Krox20促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合;另一方面,过表达miR-124的雪旺细胞能够抑制星形胶质细胞活化相关信号通路的激活,可能降低形成瘢痕能力。我们推测移植过表达miR-124的雪旺细胞于脊髓损伤部位后可能改造损伤微环境,增强雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合,抑制星形胶质细胞活化和形成瘢痕,促进脊髓损伤修复。