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血小板因子4(platelet factor4，PF4)属趋化性细胞因子CXC亚家族，分子量为7767，基因定位于4号染色体长臂。它在巨核细胞中合成，在α颗粒中包装，在血小板粘附、聚集等活化状态时以高分子量蛋白多糖-PF4复合物的形式从血小板中释放。 PF4具有多种生物学功能。其除了趋化因子共有的调节炎症反应和介导免疫应答外，更主要的是一种造血及血管生成的负性调控因子。PF4能降低正常造血干细胞对化疗药物的敏感性，其机制是可逆性地抑制细胞增殖，将细胞阻止在S期，同时还可保持其活力，而对肿瘤细胞生存能力及化疗敏感性没有明显作用。因此PF4可用于临床作为治疗肿瘤时造血细胞的防护剂。PF4还是一种血管生成的抑制因子。已证实PF4在体内有抑制实体肿瘤生长的作用，就是通过抑制肿瘤诱导的血管新生机制来抑制肿瘤生长。PF4可优先同体内血管生成活跃 第四军医大学硕士论文的组织部位结合，这为肿瘤的靶向治疗提供可能。 本研究的目的是对重组人 PF4（rhPF4）基因克隆、表达、纯化及活性分析，以获得有活性的rhPF4，为下一步的深入研究和临床应用奠定基础。 本文首先人工合成了 rhPF4 cDNA的两条寡核茸酸链，经 PCR一轮反应，得到PF4基因的全长模板。再合成rhPF4基因的扩增引物，经PCR大量扩增PF4 g因。PF4基因扩增产物经纯化后，克隆入大肠杆菌克隆载体 pUC中，筛选带有插段的阳性克隆，经序列测定，证实基因正确无误。再将测序正确的PF4基因亚克隆入大肠杆菌融合表达载体pGEXAT3中，经酶切鉴定后将重组表达载体命名为pGEX－4T）PF4。将 pGEXAT3fF4转化大肠杆菌 DH5a，用 lmmol／L IPTG于 37T 4小时诱导 pGEX－4T3－PF4的表达，并进行 western blot t＊变分析和蛋白表达形式分折石DS－PAGE结果表明：重组表达载体pGEX－4T3．PF4在大肠杆菌DH5a中得到表达，表达产物GSTPF4融合蛋白分子量约为34 KDKD，与二者分子量之和相符。光密度扫描结果表明，GSTPF4融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的 20％。western blot印迹检测到了该融合蛋白的特异存在，而以空白菌株作为对照的泳道上则无任何杂交带。通过对不同裂菌组分的电泳分析发现，表达蛋白均以包涵体形式存在。 为使包涵体形式表达的GSTPF4融合蛋白以可溶形式分泌，本文尝试了改变诱导条件。我们首先将宿主菌改为BLZI（DE3卜并用WTG低温诱导（28－30℃），SDS－PAGE结果表明，表达产物有50O出现于细菌外周质中，为可溶性。接着本文利用 Glutathione Sepharose 4B对可溶性表达的GSTPF4 融合蛋白直接进行亲和层析纯化，再利用GSTPF4融合表达蛋白上的凝血酶识别位点，用凝血酶将GST从目的 ．4． 第四军医大学硕士论文蛋白的N段切除。将纯化后的蛋白进行蛋白定量，结果表明所得到的蛋白浓度约为0329／L。本文还采用鸡胚尿囊膜血管生长抑制模型 （CAM）进一步对纯化复性后的 rhPF4进行初步的活性鉴定。实验结果表明，本实验所得到的dF4对CAM血管生长具有抑制活性。 PF4作为一个多功能趋化因子，具有潜在的应用前景，随着其竹用机制的进一步阐明，它可能会成为一种有效的临床药物。以上买验结果表明rhPF4cDNA基因己成功扩增、克隆，并在融合表达载体中获得可溶性表达，表达产物得到有效纯化，纯化后初步鉴定其具有生物学活性，为进一步研究其机制及其临床应用奠定了基础。