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水牛是中国南方重要家畜之一,由于其繁殖效率低下及优秀种质资源缺乏,严重制约了水牛产业的发展。精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs)是动物种质资源改良和新品种培育最具潜力的种子细胞之一,已成为当前动物繁殖学领域研究的热点。目前小鼠SSCs体外培养系统已较成熟,但是水牛相关研究较少,已知的SSCs体外培养系统尚不能满足水牛SSCs体外长期培养需求。本研究拟通过探索影响水牛精原干细胞富集及体外增殖的相关因素,为优化当前水牛SSCs体外培养系统奠定基础。取得的主要研究成果如下:1.探讨了影响水牛支持细胞(sertoli)饲养层细胞制备的相关因素。水牛睾丸细胞悬液经差异贴壁6 h,对已贴壁细胞用sertoli细胞特异性抗体WT1免疫荧光染色并计数,其纯度可达95%以上。以不同浓度丝裂霉素C处理sertoli细胞,结果显示,3.0 μg/mL丝裂霉素C处理组细胞增殖显著低于对照组和1.5μg/ml裂霉素C处理组,但与其它处理组无显著差异,所以制备sertoli饲养层细胞的丝裂霉素C处理浓度以3.0 μg/ml为宜。收集不同代sertoli细胞(0-10代),采用qRT-PCR分析sertoli细胞特异表达基因,结果显示,P6、P7和P8代的sertoli细胞中GDNF表达量显著高于其它代细胞,而P7和P8代的SCF与FGF2表达量显著高于其它代细胞。2.观察了不同年龄水牛SSCs相关基因的表达状况。利用DDX4抗体与PGP9.5抗体对水牛睾丸组织SSCs进行定位,发现SSCs主要分布于曲细精管基底膜附近。采用qRT-PCR分析青春期前和成牛水牛睾丸细胞悬液SSCs相关基因的表达,结果显示青春期前睾丸细胞悬液Nanos2表达量显著高于成年水牛。水牛睾丸细胞悬液经明胶和鼠尾胶原蛋白差异贴壁富集SSCs细胞,结果显示富集后的细胞PGP9.5阳性细胞数量显著高于未差异贴壁组,并且经差异贴壁PGP9.5阳性细胞数量是未差异贴壁细胞的2.3倍。3.探讨了褪黑激素(Melatonin)和CHIR-99021(简称 CHIR)对SSCs体外增殖的影响。在IMDM培养系统中分别添加不同浓度褪黑激素或CHIR,SSCs经培养4天后传代,继续培养4天后,收集细胞,对SSCs干性及生殖相关基因(PLZF,DDX4,NANOS2)、分化相关基因(DMRT1,REC8,DAZL)、氧化相关基因(CAT,SOD3)和细胞增殖相关基因(CCND1,CCNE1)进行qRT-PCR分析,结果显示,与对照组相比,10-6MMelatonin处理组SSCs中PLZF、DDX4、SOD3表达量显著高于对照组;而DMRT1和REC8显著下调;CCND1基因表达在各组中无显著差异。10-6M Melatonin处理组与对照组的DDX4和PGP9.5阳性细胞数无显著差异。添加10 μM CHIR处理组SSCs中PLZF表达量极显著高于其它组,与对照组相比,NANOS2、CCND1、CCNE1表达量显著上调;DAZL、DMRT1、CAT和SOD3均显著下调。10μMCHIR处理组DDX4和PGP9.5阳性细胞数显著高于对照组,10 μM CHIR处理组阳性细胞数增加了1.7倍。