蝗绿僵菌β-tubulin和MaPpt1基因功能研究

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当前环境问题日益突出,因施用化学农药造成的健康问题更是引人瞩目,因此需要开发可替代化学农药或者补充性的生物农药来保护环境。由于所有的昆虫都易受昆虫病原真菌感染而致病,因此昆虫病原真菌的传播和扩散会造成大面积的昆虫群体因感染昆虫病原真菌而死亡。故利用昆虫病原真菌控制农业害虫实施生物控制和病虫害综合治理是保护绿色环境的重要途径之一。在昆虫病原真菌的生活史中,首先是孢子遇到昆虫后通过分泌的黏液附着到昆虫体表,同时孢子膨大,紧接着萌发产生芽管。芽管在昆虫体表找到合适的位点后开始进行穿透。紧接着芽管的顶端开始膨大产生附着胞;附着胞进而产生穿透钉;穿透钉透过表皮进入昆虫血腔;进入血腔后,菌丝由丝状转变为酵母状的虫菌体;虫菌体以血腔中的血液为营养迅速繁殖生长;昆虫死亡后,昆虫病原真菌从血腔内穿透皮层再次产生分生孢子进入下一个周期。植物病原真菌和昆虫病原真菌具有相似的侵染过程。植物病原真菌侵染过程中与植物抗性基因对应的基因称为无毒基因,包括细胞骨架蛋白和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶等无毒基因。与植物病原真菌无毒基因对应的昆虫病原真菌基因,如β-tubulin和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶Ppt1,在昆虫病原真菌中的功能了解甚少,研究它们的功能对于了解昆虫病原真菌的致病机制和杀虫真菌农药的研制具有重要意义。  β-tubulin是组成微管的基本单元之一,微管又是构成细胞骨架的成分。β-tubulin参与多种细胞生物学过程。本文采用基因敲除和回复的方法研究了β-tubulin基因对蝗绿僵菌的细胞形态、产孢、抗逆和毒力的影响。敲除β-tubulin基因后削弱了蝗绿僵菌正常的细胞核分离、脂滴的运输、几丁质到隔的沉积;导致菌丝弯曲,并形成菌落密实填集的褶皱形态;孢子梗减少、产孢量显著下降。与野生型和回复菌株相比,敲除β-tubulin基因显著削弱了蝗绿僵菌的侵染蝗虫的毒力,侵染结构会产生二叉型芽管、附着胞形成率显著下降,附着胞的形态异常且膨压下降;β-tubulin基因缺失后,蝗绿僵菌在蝗虫活体内和离体蝗虫血清中生长显著减缓。与野生型和回复菌株相比,敲除β-tubulin基因后蝗绿僵菌孢子对紫外、热等逆境的耐受性无显著变化。因此,β-tubulin对蝗绿僵菌菌丝生长、产孢和毒力有重要作用,对抗逆特性无明显影响。  丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶Ppt1(酵母)/PP5(人)包含一个特有的三肽重复序列,主要调节生长、分化、DNA损伤修复、细胞周期,参与热激反应的信号传导。但是Ppt1/PP5在丝状真菌中的功能至今还未见报道。本研究敲除丝状真菌蝗绿僵菌的Ppt1基因后菌落形态显著性改变,产孢方式发生改变:从正常产孢变为微循环产孢;MaPpt1敲除菌株的热激反应和毒力没有变化,但紫外耐受性能力显著提高。eGFP-MaPpt1蛋白的融合表结果达表明MaPpt1在生长的菌丝中定位在隔上,在孢子中分散在整个细胞质中。通过磷酸化蛋白质组学分析发现了MaPpt1(ΔMaPpt1 vs WT)作用的11个潜在靶标蛋白,数字表达谱分析发现MaPpt1可能调控的基因1846个,两种方法的研究结果共同揭示MaPpt1参与了包括脂肪酸代谢,细胞周期、DNA修复和糖酵解/糖异生的信号网络。本研究为阐明蝗绿僵菌等丝状真菌的产孢调控和紫外耐受性的分子机制提供了科学依据。
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