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目的:随着交通事业及工农业的发展,周围神经损伤成为临床上常见疾病。周围神经损伤的显微外科修复技术已经十分精湛,却长期以来难以获得满意结果。随着分子生物学和基因转移技术不断进步,神经损伤的基因治疗研究正在兴起。周围神经损伤后再生是一个极为复杂的生物化学和细胞学过程。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子(NTF)的第二成员,是一种主要存在与脑及脊髓中,能够维持中枢神经系统多种神经元存活及促进神经轴突生长的碱性蛋白。但BDNF基因在正常的中枢神经中表达量较少。神经受损后虽然BDNF表达明显增多,但表达量不稳定,时间短。应用复制缺陷型重组腺病毒(Adenovirus,AdV)为载体导入受损的周围神经各种神经营养因子的基因治疗促进其修复再生具有特异、高效、安全等有点,已成为神经修复研究领域的前沿。本实验将Wistar大鼠随即分为三组:正常Wistar大鼠组(A组),对照组(B组),实验组(C组)。将腺病毒介导的脑源性神经营养因子(BDNF)(C组)或不携带外源基因的Ad0(B组)通过微量注射器导入Wistar大鼠腰膨大脊髓实质内,比较转染外源性BDNF后与导入Ad0后BDNF基因在脊髓前角表达的情况,计数BDNF染色阳性细胞数,并比较与正常对照组大鼠脊髓中内源性BDNF表达的情况;并通过多聚酶链反应(PCR)检测腺病毒在B、C两组脊髓中的存活时间,采用病毒液10倍系列稀释提取DNA检测出腺病毒的特异性条带的最低稀释度,应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测BDNF基因在大鼠脊髓中的表达情况及表达时间,以探讨腺病毒介导的外源性BDNF基因对脊髓中BDNF基因表达的影响因素。方法:选用7周龄健康雌性Wistar大鼠180只,体重200-250g。将大鼠随机分成三组,每组60只。正常Wistar大鼠组(A组)为正常大鼠,不导入腺病毒及其携带的基因;对照组(B组)导入Ad0;实验组(C组)导入AdBDNF。将实验对照组及实验组大鼠经腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg),麻醉成功后固定于脑立体定位仪上。取长约2cm后正中切口,去除T13椎板,暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-Ⅲ型手动推进器,于脊髓后正中动脉右侧0.8mm处注射Ad0(5×10~9pfu/ml)1μl(B组)或AdBDNF(1×10~9pfu/ml)1μl(C组)。针尖向头侧呈45度斜行进针,斜行刺入深度为2.5mm。注射速度为1μl/min,注射完毕后滞针5min,缓慢拔针。充分止血、冲洗伤口,局部喷洒抗生素预防感染,关闭伤口。B、C组大鼠转染病毒后2天、4天、7天、2周、3周、4周、5周取材,A组大鼠任意时间取材,标本为大鼠脊髓。对三组大鼠脊髓进行厚40μm的连续冰冻横切片经行免疫组织化学染色,计数三组中不同时间点BDNF在脊髓前角运动神经元染色阳性的细胞数,分析比较三组BDNF基因在脊髓表达的高峰期和持续时间。PCR及RT-PCR实验标本取B、C两组2天、4天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周大鼠脊髓标本及A组任意时间脊髓标本。将三组脊髓标本捣成匀浆,多聚酶链反应(PCR)监测B、C两组病毒注入脊髓的存活时间,采用病毒液10倍系列稀释提取DNA检测腺病毒的灵敏度;应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测三组组BDNF基因在大鼠脊髓中表达的情况。结果:1 BDNF转基因表达:BDNF染色阳性细胞多存在脊髓双侧的前角运动神经元和周围的胶质细胞。表达范围局限于注射点上下各0.5cm区段,转基因表达的阳性冰冻横切片数A组冰冻切片数≤26片,B组冰冻切片数≤60片,C组阳性细胞冰冻切片数≤103片。转基因神经元在注射同侧表达明显较对侧强烈。切片观察可见A组内源性BDNF阳性细胞主要分布与脊髓灰质前角神经元,分布较均匀;B组的BDNF染色阳性表达时间约为5周;C组的BDNF染色阳性表达时间约为5周。脊髓阳性细胞计数显示B组BDNF在脊髓表达较A组强烈,高峰期为转染Ad0后在1周,以后逐渐下降,但至五周后仍高于A组水平;C组BDNF在脊髓中的表达较A、B两组显著强烈,高峰期为转染AdBDNF后1周,至5周后表达下降但仍高于A,B组水平。统计学分析表明B、C两组在高峰期间BDNF阳性细胞数计数有显著差异(P＜0.05),B组在高峰期与A组,C组在高峰期与A组的BDNF阳性细胞计数有显著差异(P＜0.05)。2 PCR及RT-PCR检测:2.1脊髓标本腺病毒PCR的检测:用PCR法从DNA水平分别检测腺病毒在实验对照组、实验组的脊髓标本中存活时间。腺病毒的DNA量是随时间延长逐渐下降的,直至第十周检测不到腺病毒的表达。2.2 RT-PCR检测BDNF基因在大鼠脊髓组织的表达:用RT-PCR法从mRNA水平分别检测正常组,实验组、对照组中BDNF的表达情况:正常实验组中可监测出一定量的BDNFmRNA,随时间没有变化趋势。转然1天后两组均可检测出BDNFmRNA在脊髓组织中表达,对照组表达上调高峰为术后7天,高表达量可持续到第五周,到第八周降至正常组水平。实验组表达上调高峰为术后7天,高表达量可持续五周,到第十周降至正常组水平。统计学分析表明B、C两组之间在表达高峰期间BDNFmRNA表达数量显著差异,(P＞0.05),两组组内不同时间点比较BDNFmRNA表达量有显著差异(P＜0.05)。结论:通过三组大鼠脊髓标本的BDNF免疫组织化学染色及RT-PCR检测,可以表明在正常Wistar大鼠脊髓中,BDNF染色阳性细胞主要存在与脊髓前角,分布较均匀。将不介导外源性基因腺病毒Ad0注射入脊髓引起的脊髓机械性(微量注射器刺激)及化学性(腺病毒引起的大鼠脊髓的局部炎症反应与机体免疫反应)损伤,导致BDNF在脊髓中的表达增加。携带外源性BDNF基因的腺病毒载体导入大鼠脊髓中,能引起BDNF在脊髓中较注射Ad0更强烈的表达。这表明外源性BDNF基因有叠加作用。