论文部分内容阅读
香菇是我国食用菌产业中的支柱产品，占食用菌总产量的三分之一，种植香菇是山区致富奔小康的重要途径。香菇为优良食用菌，以香味鲜美而著称，为珍馐良药。香菇多糖除对疾病有特殊的治疗效果外，它的作用往往是综合的，它们都有滋补强化、扶正固本、抗衰老的作用，是一种天然补品。为了能使高品质的香菇品种得到产业化的生产，其转基因技术研究显得尤其重要。本研究的主要目的是分离鉴定适用于香菇转基因得高效表达启动子，为建立香菇外源基因表达系统提供顺式元件。 以香菇L26基因组DNA为模板，根据以往报道的RAS、GPD启动子相关序列设计引物，利用PCR方法克隆了RAS、GPD1和GPD2三个香菇启动子片断。DNA序列测定结果表明，RAS为715bp，GPD1为1056bp，GPD2为613bp。BLASTn搜索结果表明，RAS序列与以往报道的ras启动子序列同源性很好，达92％；GPD1与报道gLeGPD基因同源性达96％；GPD2与报道gLeGPD gene同源性达97％。采用Promoter Scan和PlantCARE软件对序列进行分析，结果表明序列的正负链各有一个启动子区，含有TATA-box，CAAT-box，G-box，GC-motif，Sp1-box，CT rich-motif等顺式作用元件。采用Tfsitescan service软件分析克隆的启动子片断，结果表明，该片断含有多个转录因子如GCR1，GCN4，AFT1，nit2，GF1等的结合位点。 将启动子的三个片段分别与gus报道基因和nos终止子连接，构建成真菌表达载体pRAS、pGPD1和pGPD2。通过原生质体电击转化的方法将三个表达载体分别转化到草菇菌丝的原生质体中，筛选出的转化子GUS活性表明，三个启动子片段都有启动报告基因在草菇菌丝中表达的功能，其启动活性比较结果表明，RAS启动活性最强。 细胞色素P450酶系在生物体中具有重要的功能——对许多内源性和外源性的化学物质尤其是对环境有害化学物质存在氧化代谢作用，而受到广泛平南必命未六大李·硕士研宪吸牟六俗灰的重视。它的广泛分布、多样的结构、复杂的功能及其基因的多层次调控可以说是其重要性的体现。为使香菇细胞色素P450基因可以很好的进行体外表达或基因工程生产此酶，我们以香菇L26基因组DNA为模板，设计引物，利用PCR技术克隆香菇细胞色素P450基因，得到一个片断一A126序列长度为93sbp，其有一段(448bp)序列与报道的香菇Le.e即1 gene for eytoehromeP4501同源性达98%以上。BLASTx搜索结果表明，A126序列预测氨基酸序列与以报道香菇eytoehrome p45o 2 Le.CYPZ和eytoehrome p45ol同源性都能达60%。基本上可以确定A126序列就是香菇细胞色素P450基因全长序列的一部分。