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植物RNA病毒载体表达系统是一种以植物为生物反应器的新型表达平台。番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）在生物安全性和外源基因承载量等方面具有潜在的优势，是一个构建新型植物RNA病毒表达载体的理想材料。实验室前期构建了一系列TBSV病毒表达载体并能够在寄主本氏烟上表达报道基因。在后续研究中发现，构建的TBSV病毒表达系统的表达稳定性较差，极大地限制了该表达平台的应用。 针对上述问题，本研究在前期构建的TBSV病毒表达载体的基础上，优化载体设计并利用亚克隆技术构建了相关TBSV病毒表达载体。以农杆菌渗滤接种法接种于植物烟草本氏烟，开展了如下相关研究。 ①通过亚克隆技术对pTBSV-WY1载体的外源基因插入位点进行了修改，构建了病毒表达载体pTBSV-WY2。整株、细胞以及分子水平等三个层次的比较研究表明，pTBSV-WY2表达载体的表达效率和稳定性都明显优于pTBSV-WY1。证明外源基因插入位点的选择十分重要，合适的外源基因插入位点能够提高外源基因的表达水平和载体的表达稳定性。 ②选取拟南芥ACT2启动子(AB026654，57962-58748 bp)，通过启动子更换，在pTBSV-WY2的基础上获得病毒表达载体pTBSV-WY3。比较研究表明，来源不同的两个Ⅱ型启动子（35S启动子和ACT2启动子）驱动的病毒载体在外源基因的最大表达量上无显著差异;二者在外源基因表达的时间变化规律上存在差异，推测时间变化规律上差别与启动子本身的性质有关。 ③对在病毒基因组编码区内引入内含子以提高病毒载体表达效率的可行性和规律性进行了探索。通过亚克隆技术，在TBSV病毒基因组不同位置分别引入2个、9个和11个内含子，构建了TBSV病毒表达载体pTBSV-WY3-2intr，pTBSV-WY3-9intr和pTBSV-WY3-11intr。Northern blot结果表明，引入病毒基因组内的内含子在植物体内能够被识别并剪切。GFP定性和定量分析结果表明，在病毒基因组内插入内含子对外源基因表达量并无显著影响。结合前人相关研究，推测可能与所插入内含子的位置、数量和大小等有关，这还需要开展进一步的研究。 相关研究结果有助于进一步优化TBSV病毒表达载体，从而使TBSV病毒表达载体得到更好的应用。同时，研究结果也将对指导其他植物RNA病毒载体表达系统的深入研究奠定理论基础。