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根据糖尿病（diabetes mellitus,DM）流行病学调查显示,在中国的成年人群中,糖尿病患病率约为12.8%,糖尿病引起的代谢紊乱及其所导致的血管并发症带来了沉重的社会及经济负担[1]。糖尿病微血管并发症可能累计多个器官,最常见的是糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）和视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）,而其共同的病理机制为微血管内皮屏障功能障碍[2-5]。环状RNA（circRNA）是一种具有共价闭合环的长链非编码RNA,对核酸外切酶具有天然抗性[6,7]。近年来,circRNAs已被确定为多种疾病的重要调节因子,如癌症、心血管疾病和代谢类疾病等[8-10],最经典的circRNA生物学功能是竞争性结合miRNA并调控靶mRNA表达[10]。最近,越来越多的焦点集中在circRNA对肾脏和视网膜疾病发生发展的作用,但是否存在关键的circRNA可以共同调控糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病的疾病进展,仍需进一步研究。在此研究中,运用人肾小球内皮细胞（human glomerular endothelial cells,HGECs）、人脐静脉内皮细胞[11-14]（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）和STZ诱导糖尿病小鼠构建糖尿病微血管内皮细胞和动物模型,以研究糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病疾病发展过程中circRNA对微血管内皮屏障功能的保护作用。第一部分circ＿0010433在糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变中低表达目的筛选糖尿病视网膜病变/糖尿病肾病中改善微血管内皮细胞功能的关键circRNA。方法1.将受试者分为:糖尿病视网膜病变组（DR组）、糖尿病肾病组（DN组）、糖尿病视网膜病变合并糖尿病肾病组（DR+DN组）、无血管并发症的糖尿病组（DM组）和健康对照组（CON组）,收集各组临床检验数据并作统计学分析。2.分别将HGECs和HUVECs随机分为3组:正常糖组（NG组）、高渗组（HM 组）和高糖组（HG 组）,通过 qRT-PCR、Western blot 和 IF 检测 CD31、vWF、ICAM-1和VCAM-1表达变化,验证高糖环境下HGECs和HUVECs是否发生损伤现象。3.对circ＿0010433的环状结构进行鉴定,并行FISH实验明确circ＿0010433细胞定位。4.将DR组、DN组、DR+DN组和CON组患者的血清样本、肾组织或玻璃体液样本行qRT-PCR验证circ＿0010433的表达变化。5.分别将HGECs和HUVECs随机分为3组:NG组、HM组和HG组,通过qRT-PCR检测circ＿0010433表达变化。结果1.DR+DN组患者与DN组相比,ACR显著升高（P＜0.05）,eGFR显著降低（P＜0.05）。2.HG组的HGECs和HUVECs中CD31和vWF表达显著下调（P＜0.05）,ICAM-1和VCAM-1表达显著上调（P＜0.05）。3.DN组和DR+DN组患者的肾组织和血清中circ＿0010433表达均较CON组显著减少（P＜0.05）。DR组和DR+DN组患者的玻璃体液样本和血清中circ＿0010433表达均较CON组显著减少（P＜0.05）。4.HG 组的 HGECs 和 HUVECs 中 circ＿0010433 表达显著减少（P＜0.05）。结论Circ＿0010433是糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病发病过程中共同存在的circRNA,且在糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病时均呈低表达。第二部分circ＿0010433可改善糖尿病微血管内皮细胞损伤目的通过体内、体外实验明确circ＿0010433在糖尿病微血管内皮细胞损伤过程中的保护作用。方法1.分别将 HGECs 和 HUVECs 分为 3 组:NG 组、NG-Negtive 组和 NG-KD组,qRT-PCR、Western blot和IF检测CD31、vWF、ICAM-1和VCAM-1表达变化。2.分别将 HGECs 和 HUVECs 分为 3 组:HG 组、HG-vehicle 组和 HG-OE组,qRT-PCR、Western blot和IF检测CD31、vWF、ICAM-1和VCAM-1表达变化。3.将 HGECs 分为 2 组:NG-Negtive 组和 NG-KD 组（n=3）,并进行 RNA-Seq测序以探索circ＿0010433的靶基因。4.分别将HGECs和HUVECs细胞分为3组:NG组、HM组和HG组,通过 qRT-PCR、Western blot 和 IF 检测 CHGA 表达变化。5.分别将HGECs和HUVECs细胞分为3组:NG组、NG-Negtive组和NG-KD组,qRT-PCR检查CHGA表达变化,Western blot检测CgA和VS-1/2表达变化,以及IF检测CHGA和ICAM-1的表达变化。6.分别将HGECs和HUVECs细胞分为3组:HG组、HG-vehicle组和HG-OE组,qRT-PCR检测CHGA表达变化,Western blot检测CgA和VS-1/2表达变化,以及IF检测CHGA和ICAM-1的表达变化。7.分别将HGECs和HUVECs细胞分为3组:NG组、HG组和HG+CgA1-439 组,通过 Western blot 和 IF 检测 CD31、vWF、ICAM-1 和 VCAM-1 的表达变化。8.将C57小鼠和STZ诱导糖尿病小鼠随机分为4组:C57组、STZ组、+Vehicle组和+circ＿0010433 OE组,检测小鼠的ACR、肾小球内皮细胞肿胀数量、视网膜无细胞毛细血管数量及视网膜无灌注区面积等,并行小鼠的视网膜铺片HE染色、肾组织切片PAS染色、视网膜和肾组织切片免疫荧光检测CD31、ICAM-1和CHGA,以明确circ＿0010433过表达对糖尿病时视网膜和肾脏微血管内皮细胞屏障的调节修复作用。结果1.NG-KD组的HGECs和HUVECs中CD31和vWF表达显著下调（P＜0.05）,同时ICAM-1和VCAM-1表达显著上调（P＜0.05）。2.HG-OE组的HGECs和HUVECs中CD31和vWF表达较HG组显著上调（P＜0.05）,同时ICAM-1和VCAM-1表达较HG组显著下调（P＜0.05）3.RNA-Seq结果显示CHGA在NG-KD组HGECs中显著下调（logFC=-1.073,P=0.002）。4.HG组的HGECs和HUVECs中的CHGA、VS-1和VS-2表达较NG组显著下调（P＜0.05）,ICAM-1表达显著上调（P＜0.05）。5.NG-KD 组的 HGECs 和 HUVECs 中 CgA、VS-1 和 VS-2 表达较 NG 组显著下调（P＜0.05）,同时ICAM-1表达显著上调（P＜0.05）。6.HG-OE 组的 HGECs 和 HUVECs 中 CgA、VS-1 和 VS-2 表达较 HG 组显著上调（P＜0.05）,同时ICAM-1表达较HG组显著下调（P＜0.05）。7.HG+CgA1-439 组的 HGECs 和 HUVECs 中 CD31 和 vWF 表达较 HG 组显著上调（P＜0.05）,ICAM-1和VCAM-1表达水平较HG组显著下调（P＜0.05）。8.+circ＿0010433 OE组小鼠的ACR、肾小球内皮细胞肿胀数量、视网膜无细胞毛细血管数量和视网膜无灌注区面积均较STZ组显著减少（P＜0.05）。免疫荧光显示+circ＿0010433 OE组小鼠的肾小球和视网膜中CD31和CHGA表达较STZ组表达上调,ICAM-1表达下调。结论circ＿0010433是一种抗内皮损伤基因,其表达减少可致使或加重糖尿病微血管内皮细胞损伤,其在高糖条件下有内皮保护效应,可为糖尿病微血管内皮屏障损伤治疗提供一种新策略。第三部分circ＿0010433竞争性结合m i R-6799-3p调控CHGA缓解高糖致内皮功能障碍目的探索circ＿0010433参与修复糖尿病微血管内皮屏障的作用机制,明确circ＿0010433、miR-6799-3p 和 CHGA 的结合关系。方法1.利用生信分析、双荧光素酶实验、qRT-PCR和RNA免疫共沉淀（RIP）技术明确circ＿0010433和miR-6799-3p的结合关系。2.利用生信分析、双荧光素酶实验和Western blot技术明确CHGA和miR-6799-3p的结合关系。3.分别将HGECs和HUVECs细胞分为5组:NG组、+Negtive组、+siRNA-circ＿0010433 组、+miR-6799-3p-inhibitors 组和+both 组。用 qRT-PCR、Western blot和IF检测 CgA、VS-1、VS-2、CD31、vWF、ICAM-1和 VCAM-1表达变化,以明确circ＿0010433和/或miR-6799-3p下调时CHGA的变化和内皮损伤的程度。4.分别将HGECs和HUVECs细胞分为5组:NG组、+Vehicle组、+circ＿0010433OE 组、+miR-6799-3p-mimics 组和+both 组。用 qRT-PCR、Western blot和 IF检测 CgA、VS-1、VS-2、CD31、vWF、ICAM-1和 VCAM-1表达变化,以明确circ＿0010433和/或miR-6799-3p上调时CHGA的变化和内皮损伤的程度。5.分别将HGECs和HUVECs细胞分为5组:HG组、+Vehicle组、+circ＿0010433OE 组、+miR-6799-3p-mimics 组和+both 组。用 qRT-PCR、Westernblot和IF检测 CgA、VS-1、VS-2、CD31、vWF、ICAM-1和VCAM-1表达变化,以明确高糖条件下circ＿0010433和/或miR-6799-3p上调对CHGA的变化和内皮损伤程度的影响。结果1.生信分析、双荧光素酶、RIP、qRT-PCR和Western blot实验结果显示miR-6799-3p 是 circ＿0010433 和 CHGA 的桥梁 miRNA。2.正常糖时,+siRNA-circ＿0010433 组的 HGECs 和 HUVECs 中的 CgA、VS-1、VS-2、CD31 和 vWF 的表达较 NG 组显著减少（P＜0.05）,ICAM-1 和VCAM-1 表达显著增加（P＜0.05）。+miR-6799-3p-inhibitors 组的 HGECs 和HUVECs中的CgA、VS-1、VS-2、CD31和vWF的表达较NG组显著增加（P＜0.05）,ICAM-1 和 VCAM-1 表达显著减少（P＜0.05）。+both组的 HGECs和 HUVECs 中的 CgA、VS-1、VS-2、CD31 和 vWF 表达较+siRNA-circ＿0010433组显著增加（P＜0.05）,ICAM-1和VCAM-1表达显著减少（P＜0.05）。3.正常糖时,+circ＿0010433OE 组的 HGECs 和 HUVECs 中的 CgA、VS-1、VS-2、CD31和vWF的表达较NG组显著增加（P＜0.05）,ICAM-1和VCAM-1表达显著减少（P＜0.05）。+miR-6799-3p-mimics 组的 HGECs 和 HUVECs 中的CgA、VS-1、VS-2、CD31和vWF的表达较对照组显著减少（P＜0.05）,ICAM-1 和 VCAM-1 表达显著增加（P＜0.05）。+both 组的 HGECs 和 HUVECs中的 CgA、VS-1、VS-2、CD31 和 vWF 表达较+circ＿0010433OE 组显著减少（P＜0.05）,ICAM-1 和 VCAM-1 表达显著增加（P＜0.05）。4.高糖时,+circ＿0010433OE 组的 HGECs 和 HUVECs 中的 CgA、VS-1、VS-2、CD31 和 vWF 的表达较 NG 组显著增加（P＜0.05）,ICAM-1 和 VCAM-1表达显著减少（P＜0.05）。+miR-6799-3p-mimics 组的 HGECs 和 HUVECs 中的CgA、VS-1、VS-2、CD31和vWF的表达较对照组显著减少（P＜0.05）,ICAM-1 和 VCAM-1 表达显著增加（P＜0.05）。+both 组的 HGECs 和 HUVECs中的 CgA、VS-1、VS-2、CD31 和 vWF 表达较+circ＿0010433OE 组显著减少（P＜0.05）,ICAM-1 和 VCAM-1 表达显著增加（P＜0.05）。结论过表达circ＿0010433通过竞争性结合miR-6799-3p调节CHGA表达升高,对高糖环境下的内皮细胞损伤有修复作用。全文结论1.circ＿0010433在糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变中呈低表达。2.高糖时circ＿0010433下调并导致微血管内皮细胞损伤,过表达circ＿0010433可对高糖所致内皮细胞损伤有修护作用。3.过表达circ＿0010433通过竞争性结合miR-6799-3p调节CHGA抑制ICAM-1/VCAM-1的表达,以发挥对糖尿病微血管内皮屏障损伤的修复作用。