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研究背景诱导恶性肿瘤细胞的凋亡和增强化疗药物的敏感性是治疗卵巢癌的重要方向。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡,包括两种死亡途径,即死亡受体途径与线粒体途径。死亡受体途径又称外源性凋亡途径,是通过死亡配体与其细胞膜上的相应的受体结合,然后通过DISC的形成以激活caspase8/10,并最终激活caspase3启动细胞凋亡。线粒体通路又称内源性凋亡途径,是线粒体接受外界凋亡刺激信号后释放细胞色素C至细胞浆中,细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子1、caspase9及ATP等相互作用导致凋亡小体的形成,进而激活caspase3从而诱发凋亡。Smac是一种线粒体蛋白,在凋亡刺激信号下,与细胞色素C一起自线粒体释放入细胞胞浆内,通过其N端的四个氨基酸残基AVPI结构域,与IAPs家族中的各个蛋白的BIR结构域结合,而IAPs正是通过该结构域与caspase家族结合以抑制caspase的凋亡作用,从而发挥抑制凋亡作用。因此,Smac蛋白能够使IAPs丧失与caspase的结合能力,促进IAPs的降解,从而使caspase能够发挥凋亡作用。IAPs是化疗药物促凋亡过程中的关键蛋白,决定了化疗敏感性及耐受性,因此IAPs成为治疗恶性肿瘤的新靶点,IAPs的抑制蛋白Smac蛋白也成为治疗恶性肿瘤的新方法。为此,很多Smac蛋白的模拟物问世。Smac蛋白的模拟物有多聚核苷酸,Smac多肽,Smac小分子三种。其中Smac小分子为一种小分子化合物,因其具有较强细胞膜穿透作用、代谢周期长、生物利用度较高等优点而成为目前研究的热点。2004年美国德克萨斯大学西南医学中心根据Smac蛋白的N端功能结构域设计合成了一种具有Smac蛋白生物学活性的Smac蛋白模拟物,命名为Smac小分子compound3。顺铂是卵巢癌治疗的一线化疗药物之一,其主要作用机制是作用于DNA链间及链内交链,能够与DNA形成复合物从而干扰DNA的复制,并且能够与核蛋白或者胞浆蛋白结合,损害细胞膜结构,干扰细胞的生理功能,最终引起细胞凋亡。研究目的通过检测compound3与顺铂作用于人卵巢癌细胞SKOV3后的生长抑制作用、细胞凋亡作用及XIAP.caspase3的表达,探讨compound3对人卵巢癌细胞SKOV3对顺铂的敏感性的影响。材料与方法材料：人卵巢癌细胞SKOV3来源于上海中国科学院细胞库。顺铂购买于山东齐鲁制药公司。compound3为2004年美国德克萨斯大学西南医学中心实验室根据Smac蛋白的N端的氨基酸序列AVPI结构域合成的一类具有Smac蛋白生物学活性的小分子化合物。方法：人卵巢癌细胞SKOV3培养至细胞成对数生长时,进行实验分组,如下：阴性对照组(培养基常规培养)、compound3组(compound3的应用浓度为100nmol/L的浓度,是美国德克萨斯大学西南医学中心实验室推荐浓度)、顺铂组(顺铂的应用浓度为4mg/L,是实验前通过进行MTT测得的顺铂作用于人卵巢癌细胞SKOV348h的LC50)、compound3+顺铂组(compound3的应用浓度为100nmol/L的浓度,顺铂的应用浓度为4mg/L)。MTT法检测各组人卵巢癌细胞SKOV3的存活率、生长抑制率并根据存活率绘制生长曲线。Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术检测人卵巢癌细胞SKOV3的凋亡率。Western blot蛋白印迹检测人卵巢癌细胞SKOV3的XIAP、caspase3的表达。结果1.compound3对人卵巢癌细胞SKOV3的存活率的影响及绘制生长曲线：顺铂作用于人卵巢癌细胞SKOV312、24、48h后的存活率分别为(96.38±2.0)%、(88.50±1.38)%、(45.78±066)%。compound3作用于SKOV312、24、48h后的存活率分别为(98.67±0.88)%、(89.88±0.39)%、(64.18±0.92)%。compound3+顺铂作用于SKOV312、24、48h后的存活率分别为(92.2±0.99)%、(53.59±1.17)%、(25.56±0.6)%。Compoud3、顺铂均能使SKOV3的存活率降低。compound3+(?)(?)铂作用于SKOV312、24、48h后存活率降低较顺铂及compound3作用于SKOV3后的存活率降低更加明显。根据存活率绘制的生长曲线显示三组存活率均随作用时间延长而降低,具有时间依赖性。2.compound3对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制作用：compound3+顺铂、顺铂作用于SKOV324h后的生长抑制率分别为(46.4±1.17)%、(11.5±1.38)%；48h后的生长抑制率分别为(74.03±0.6)%、(54.22±0.66)%。compound3+顺铂作用于SKOV324、48h后的生长抑制率比顺铂作用于SKOV324、48h后的生长抑制率均明显升高,差异具有统计学意义。Compound3能够增强顺铂对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制作用。3.compound3对人卵巢癌细胞SKOV3的细胞凋亡作用：compound3+(?)(?)铂作用于SKOV324h后的凋亡率为(28.32±1.09)%；顺铂、compound3作用于SKOV324h的凋亡率分别为(20.8±2.09)%、(19.44±1.89)%。compound3+顺铂作用于SKOV348h后的凋亡率为(84.48±0.98)%；顺铂、compound3作用于SKOV348h后的凋亡率分别为(54.4±1.32)%、(23.59±2.04)%。compound3+顺铂作用于SKOV324、48h的凋亡率均明显高于顺铂及compound3作用于SKOV324、48h的凋亡率,差异具有统计学意义。Compound3能够促进顺铂对卵巢癌细胞SKOV3的细胞凋亡作用。4.compound3对人卵巢癌细胞SKOV3的XIAP及caspase-3的表达的影响：compound3+(?)铂作用于卵巢癌细胞SKOV324、48h后,测得XIAP的表达逐渐减低,并存在时问依赖关系。compound3及compound3+顺铂作用于SKOV324、48h后XIAP表达均降低。compound3+顺铂作用于SKOV324、48h后的caspase3的激活片段与顺铂、compound3作用与SKOV324、48h后的caspase3的激活片段相比,表达明显增高。Compound3能够使XIAP表达降低,联合顺铂应用时能够使caspase3激活片段表达升高。结论及意义1.compound3能够增强顺铂对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制作用,具有时间依赖性。2. compound3能够促进顺铂对人卵巢癌细胞SKOV3凋亡作用。3.compound3通过影响人卵巢癌细胞SKOV3的XIAP的表达来发挥其促凋亡及促生长抑制作用。