研究背景与目的：蛇毒类凝血酶(thrombin-like enzymes, TLEs)是蛇毒中与凝血酶作用机制部分相似的一类蛋白水解酶。它们属于丝氨酸蛋白酶,能够水解纤维蛋白原为纤维蛋白,具有体外促凝,体内降纤的作用。蛇毒类凝血酶因其临床应用价值而被广泛研究,如瑞士产止血剂立止血(Reptilase,商品名)就是从巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox Moojeni)中提取出的类凝血酶,国内外已广泛用于出血性疾病及手术前后出血的临床防治。我国对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的研究,最早是1967年的Cheng HC和Ouyang C等,他们于1971年和1972年相继分离出两个类凝血酶组分,经动物实验证实均有不同程度的抗凝作用。1993-2005年,唐松山等经过12年的努力,从尖吻蝮蛇蛇毒中获得了5个新的类凝血酶,并对其进行了相关的研究。尖吻蝮蛇血凝酶也是一种从尖吻蝮蛇毒液中提取分离出来的蛇毒类凝血酶,目前研究显示该酶具有良好的止血作用。2009年北京康辰医药股份有限公司将其作为国家一类新药上市销售,商品名“苏灵”,代号Saculin。该凝血酶是迄今为止我国上市产品中唯一完成全部氨基酸测序的单一组分蛇毒类止血药,其止血效果良好,而且不良反应轻,耐受性好。本实验对Saculin作为一种类凝血酶的部分生化特性及其裂解纤维蛋白原作用进行了研究,明确了该酶的作用特点。同时,对其免疫学特性进行了研究,建立了尖吻蝮蛇血凝酶多克隆抗体检测的间接ELISA法,并将其应用于临床血清抗体的检测。方法和内容：1.尖吻蝮蛇血凝酶的生化特性研究1.1pH值对酶凝血作用的影响将Saculin溶于pH值从4-9的缓冲液中,每次分别各取0.2mL的8U/mLSaculin溶液与0.2mL的牛血浆混合,血凝仪测定其凝血时间,确定Saculin的最适pH值。1.2温度对酶凝血作用的影响将1mL的Saculin水溶液与1mL的牛血浆分别于不同温度(20-50℃)下孵育3min后于玻璃试管中混合,此时开始计时至刚开始出现浑浊为终点,记录凝血时间,以确定Saculin的最适温度。1.3Ca2+对酶凝血作用的影响用注射用水配制8mg/mL人纤维蛋白原溶液和1U/mL Saculin溶液,37℃孵育3min后分别取等量100μL混合,并在混合液中加入20μL不同浓度的CaCl2溶液,使混合液中CaCl2的浓度为0.45-9.0mM,血凝仪测其凝固时间,以确定Ca2+对Saculin凝固纤维蛋白原作用的影响。1.4尖吻蝮蛇血凝酶释放纤维蛋白肽作用以0.05mol/L Tris-HCl (pH7.4)缓冲液分别配制20mg/mL人纤维蛋白原溶液、4U/mL Saculin溶液、8U/mL人凝血酶溶液。以上溶液配制好以后均于37℃充分水浴后使用。每次取4U/mL Saculin溶液、8U/mL人凝血酶溶液各1mL,均加入人纤维蛋白原溶液0.5mL混合均匀,37℃下分别孵育10min、30min、l h、2h、10h。每个反应体系孵育凝固后的产物,均于100℃沸水中煮5min以终止反应,产物13000rpm离心10min,取上清液进行高效液相色谱分析,查看其裂解的肽片段,并以纤维蛋白肽A (FpA)、纤维蛋白肽B (FpB)标准品作对照。2.尖吻蝮蛇血凝酶免疫学特性研究2.1多克隆抗体制备取体重2kg左右的雄性新西兰兔,于免疫前耳静脉取血2mL,分离制备血清,-20℃冷冻保存作为对照。初次免疫将1mg尖吻蝮蛇血凝酶溶于3mL生理盐水,与等体积的福氏完全佐剂超声乳化均匀后,对新西兰兔进行背部及肩胛部皮内、皮下多点注射(3mL/只)。3周后进行加强免疫注射,将0.5mg尖吻蝮蛇血凝酶溶于3mL生理盐水,与等体积福氏不完全佐剂超声乳化后,进行皮下多点注射(3mL/只),以后每隔2周进行同样的加强免疫注射一次,共3次。初次免疫及每次加强免疫5-7天后均于兔耳缘静脉采血2mL制备血清。用双向免疫扩散实验测定血清的抗体效价,以检验是否有抗体产生,最后一次免疫10d后,从颈动脉取全血约100mL,室温凝固后置4℃冰箱冷冻保存4h,离心分离血清,-2℃冻存备用。2.2抗体滴度测定采用双向免疫扩散法,以0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲溶液(PBS)配制1%琼脂溶胶,待琼脂粉完全溶解后,加至培养皿中。临用前以打孔器打孔,6个周边孔围绕1个中心孔,中心孔加入0.5mg/mL尖吻蝮蛇血凝酶溶液20μL,周边孔加入20μL抗血清,抗血清以pH7.8的PBS进行1：2、1：4、1：8、1：16、1：32倍比稀释。37℃恒温水浴箱扩散18-24h,观察抗体孔与抗原孔间有无沉淀线。2.3抗体的纯化采用硫酸铵沉淀法,取用生理盐水稀释的血清,边搅拌边加入饱和硫酸铵,4℃沉淀3h,10000rpm离心20min,弃上清,取沉淀溶于生理盐水后,重复上述步骤,将沉淀溶于生理盐水后装入透析袋,用生理盐水透析至无NH4+存在。所得溶液经5000rpm离心30min,上清即为纯化的抗体液,置-20℃保存。2.4间接ELISA测定抗血清效价经预实验确定适宜的抗原包被浓度,将尖吻蝮蛇血凝酶溶于0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液中包被96孔酶标板,4℃放置过夜。经过封闭、洗板后加入不同稀释度的阳性血清(尖吻蝮蛇凝血酶抗血清),阴性血清(无抗体)及稀释液各100μL/孔,37℃孵育2h,洗板后加入1：2000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,37℃温育1h。取出后充分洗涤,加入显色底物TMB应用液显色,然后用2mol/L H2SO4溶液终止反应,在酶标仪上读取OD450值。2.5抗体特异性鉴定将尖吻蝮蛇血凝酶抗原溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳完成后根据目的蛋白分子量大小及蛋白Marker的指示,切取所需凝胶转膜,转膜结束后取出PVDF膜,经过封闭、孵育一抗、孵育酶标二抗、洗膜后,孵育显色底物,并进行曝光显影,对结果进行分析。3.临床试验受试者血清抗体检测3.1血清中抗Saculin抗体检测方法学的建立参考2.4中尖吻蝮蛇血凝酶多克隆抗体检测方法及结果,建立检测人血清中抗尖吻蝮蛇血凝酶抗体的间接ELISA法的最佳实验条件,并重复10次检测此方法学的精密度。从待检阴性血清样品中随机抽取四份样品,分别进行5倍、10倍、50倍和100倍稀释后,进行血清抗体检测,根据测得的OD值,确定待检血清稀释倍数。3.2间接ELISA法检测人血清cut-off值的确定参照3.1确定的实验条件,将所获得的232份未注射尖吻蝮蛇血凝酶者血清样品进行稀释后,测定其OD值,利用SPSS13.0统计软件对所得结果绘制OD值分布曲线,建立此方法学检测人血清抗Saculin抗体的阴性值参考范围,确定其cut-off值。3.3间接ELISA法检测Saculin注射前后人抗体水平变化参照3.1确定的实验条件,对尖吻蝮蛇血凝酶临床实验受试者血清进行检测,并在每次的检测中均加入自制的兔抗Saculin抗体阳性血清、阴性血清作为系统检测对照。以给药前的稀释血清作为阴性对照,给药后相应稀释度的待测血清OD值与阴性对照OD值相比较,升高2.1倍者判为阳性,判为阳性的最高稀释度即为血清的抗体效价。结果与结论：1.尖吻蝮蛇血凝酶的最适pH值为5.5。2.尖吻蝮蛇血凝酶的最适温度为35℃左右,接近人体的正常生理温度。3.随着Ca2+浓度的不断增加,尖吻蝮蛇血凝酶所导致的纤维蛋白原溶液凝固时间缩短,说明Ca2+的存在有利于尖吻蝮蛇血凝酶的凝血活性。4. Saculin与人纤维蛋白原作用时,能很快释放出FpA片段,其保留时间为5.3min,并且随着反应时间的延长,能释放出少量的FpB,其保留时间为7.5min。5.通过免疫新西兰兔成功制备了尖吻蝮蛇血凝酶多克隆抗体,双向免疫扩散实验检测抗体滴度高达1：32,酶联免疫吸附实验测定血清效价高达1：6553600,免疫印迹法鉴定证明该抗体为尖吻蝮蛇血凝酶特异性抗体,其对尖吻蝮蛇血凝酶具有专一性。6.用于尖吻蝮蛇血凝酶临床试验受试者血清抗体检测的间接ELISA法,血清不同稀释度检测结果的变异度均小于5%,说明该方法具有较好的稳定性和重复性。血清经50、100倍稀释时,OD值较低,而5倍稀释时,OD值较高,综合考虑认为采用10倍的稀释倍数较为合理,同时以5倍稀释的结果作为辅助判断。临床试验受试者血清抗体检测的cut-off值为0.401。受试者血清经1：5和1：10稀释后,Saculin试验组和安慰剂组均为阴性结果,说明尖吻蝮蛇血凝酶对于此种临床手术中的常规给药,产生可检测抗体的几率很小,其临床应用中由于此种抗原抗体结合而导致的过敏反应的可能性也较小。