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目的:近年来随着经济的快速发展和人们生活水平的提高,动脉血栓性疾病的发病率、复发率和致死率也逐年升高,是当代医学研究的重点和热点之一。其中内皮细胞损伤是诱导血栓形成的主要因素。活性氧（ROS）作为细胞信号转导通路中的重要信号分子,在内皮细胞的生长和损伤中发挥着关键作用,是体内氧化应激的主要来源。牛蒡根寡糖（oligosaccharides from Arctium Lappa.L.root,ALR-OS）是从药用植物牛蒡根中提取纯化出来的高纯度寡糖。本实验室前期研究发现牛蒡根寡糖可以抑制Fe Cl3诱导的大鼠颈动脉和下腔静脉血栓的形成,但机制尚不明确,因此本实验通过Fe Cl3诱导的动物血栓模型以及HAEC细胞损伤模型,探究牛蒡根寡糖是否可以通过抑制机体内过度的氧化应激,并通过ERK/NF-κB信号通路调节血栓形成相关蛋白的表达,从而达到抑制血栓形成的作用。方法:1、牛蒡根寡糖对Fe Cl3诱导的颈动脉血栓形成的作用研究60只健康SD大鼠,雄性,体重180-220g,自由摄食及饮水,12小时光照,12小时黑暗循环系统饲养,随机分为以下6组:Control,Model,ALR-OS（1.0mg/kg,iv）、ALR-OS（2.0mg/kg,iv）、ALR-OS（4.0mg/kg,iv）剂量给药组,肝素（150U/kg,iv）阳性药对照组。取血管组织用电子分析天平称重并进行组织病理学检查。采用生化试剂盒检测大鼠血浆内丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）的测定;采用酶联免疫分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测大鼠血浆中血栓烷素B2（Thromboxane B2,TXB2）、6酮前列环素F1α（6-keto-prostaglandin F 1a,6-keto-PGF1a）、血管性血友病因子（Von Willebrand factor,v WF）、血小板内皮细胞黏附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule 1,PECAM-1）;Western blot测定大鼠血浆内纤维蛋白肽A（Fibrinpepide A,FPA）以及颈动脉血管NADPH氧化酶（NADPH oxidase,NOX4）、组织因子（Tissue Factor,TF）、组织因子途径抑制物（Tissue factor pathway inhibitor,TFPI）、凝血酶调节蛋白（Thrombomodulin,TM）蛋白的表达水平。2、牛蒡根寡糖对Fe Cl3诱导的人主动脉内皮细胞（Human aortic endothelial cells,HAECs）损伤的保护作用及机制研究2.1牛蒡根寡糖对Fe Cl3诱导的HAECs损伤的保护作用研究HAECs随机分为5组:Control、Model和ALR-OS各浓度给药组（0.1mg/m L、0.2mg/m L、0.4mg/m L）。不同浓度的ALR-OS预处理4h后给予Fe Cl3（0.4m M）作用2h。透射电镜观察细胞形态;应用流式细胞仪与倒置荧光显微镜检测活性氧（Reactive oxygen species,ROS）;生化试剂盒检测细胞谷胱甘肽（Glutathione,GSH）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活力、乳酸脱氢酶（LDH）释放量;ELISA方法检测6-keto-PGF1a、v WF的含量;采用荧光酶标仪检测2’,7’-二-（2-羧乙基）-5（6）-羧基荧光素乙酰甲酯（2’,7’-bis（2-carboxyethy）-5-（and-6）-carboxyfluorescein,BCECF）孵育的血小板黏附;Western blot检测细胞NADPH氧化酶（NADPH oxidase,NOX4）、组织因子（Tissue Factor,TF）、组织因子途径抑制物（Tissue factor pathway inhibitor,TFPI）、凝血酶调节蛋白（Thrombomodulin,TM）、细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases,ERK）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（Phosphorylation extracellular regulated protein kinases,P-ERK）、转录因子（Nucler factorκB,P65）及血小板内皮细胞黏附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule 1,PECAM-1）蛋白表达。2.2加入ERK抑制剂U0126对Fe Cl3诱导的HAECs损伤模型的建立HAECs随机分为5组:正常组（Control）、Fe Cl3模型组（Model）、ALR-OS给药组（0.4mg/ml）、模型组+ALR-OS给药组（0.4mg/ml）、模型组+U0126（10μM）。Western blot检测细胞内TM、TF、TFPI、ERK、P-ERK、P65及PECAM-1蛋白表达。结果:1、牛蒡根寡糖对Fe Cl3诱导的颈动脉血栓形成的作用研究与模型组相比,ALR-OS给药组可明显抑制Fe Cl3诱导的颈动脉血栓形成,管腔血栓明显减少,血栓湿重显著减轻;ALR-OS各给药组可以明显抑制Fe Cl3诱导的大鼠血浆内LDH、MDA含量的增多和SOD活力的下降;ALR-OS各剂量给药组的大鼠血浆内6-keto-PGF1α水平显著升高,TXB2、v WF、PECAM-1水平显著降低,FPA的蛋白表达量减少;ALR-OS各剂量给药组的颈动脉血管的NOX4与TF蛋白表达量降低,TFPI与TM的蛋白表达量明显升高。2、牛蒡根寡糖对Fe Cl3诱导的HAECs损伤的保护作用研究与模型组比较,ALR-OS不同浓度给药组细胞损伤程度降低,形态良好;细胞培养上清液中LDH及v WF的含量明显降低,6-keto-PGF1α的含量明显升高;细胞ROS的产生明显降低,SOD活性增强,GSH水平显著升高,血小板黏附减少;ALR-OS可上调细胞TFPI与TM蛋白的表达,下调NOX4与TF蛋白表达;ALR-OS对于Fe Cl3诱导的ERK以及NF-κB/P65蛋白的磷酸化蛋白具有明显的抑制作用。3、加入ERK抑制剂U0126对Fe Cl3诱导的HAECs损伤的作用研究与模型组相比,ALR-OS给药组和U0126均可上调细胞TFPI与TM蛋白的表达,下调NOX4、TF与P-ERK的蛋白表达以及细胞核内的NF-κB蛋白表达明显降低。结论:牛蒡根寡糖可以抑制Fe Cl3诱导的大鼠颈动脉血栓的形成,其作用机制可能与降低血液凝血活性、增强抗凝活性、调节纤溶系统、抑制血小板聚集有关。牛蒡根寡糖发挥抗血栓形成作用与其保护血管内皮细胞有关,机制可能与其抑制过度的氧化应激效应,且通过调节ERK/NF-κB信号通路及血栓形成的相关因子的表达从而发挥抗血栓作用。