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糖类是鱼类饲料中必不可少的成分,具有易得、价廉等特点。适量添加可起到节约蛋白质作用。但大多数鱼类对糖的耐受量较低,表现出一种类似糖尿病的症状。如何通过营养学手段,调控鱼类糖脂代谢功能,提升养殖动物机体对碳水化合物的利用显得尤为重要。食欲素(Orexin)是一种由下丘脑分泌的神经肽,参与机体摄食、能量稳态调节,其在哺乳动物中的功能及作用机理已经非常透彻。但在水产动物中,Orexin的作用主要关注在调控摄食方面,其在营养代谢调节方面的研究较少。基于此,本研究通过cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,获得Orexin前体基因cDNA序列,并化学合成Orexin-A蛋白,进行在体注射和离体细胞生物学实验。在体注射实验挑选健康、规格整齐的鲤(Cyprinus carpio)共450尾(平均初始体重为22.02±0.17 g),并将其随机分为5组,每组3个重复,每重复30尾。禁食24小时后,实验组以1.67 mg/g体重的剂量用灌胃针口服葡萄糖后,腹腔注射Orexin-A(0,10,100,1000 ng/g体重)。对照组灌喂PBS溶液。在实验结束后分别检测血糖含量,葡萄糖转运载体、糖酵解、糖异生相关基因的表达以及葡萄糖转运活性变化。离体细胞生物学实验通过分离培养鲤原代肝细胞,使用葡萄糖、Orexin-A孵育细胞,实验结束后检测糖吸收、糖代谢相关基因的表达。此外,为了检测Orexin-A对鲤下丘脑摄食相关神经肽的影响,我们在体内实验结束后检测了下丘脑摄食相关神经肽基因的表达。实验结果如下:1.食欲素前体基因的克隆及系统发育分析利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增的方法克隆得到鲤prepro-orexin cDNA部分基因序列。Prepro-orexin基因cDNA的部分长度为513 bp,开放读码框ORF为471 bp,编码156个氨基酸的Orexin蛋白,包括49个氨基酸的Orexin-A和28个氨基酸的Orexin-B。鲤Orexin-A序列中存在4个Cys,鲤Orexin具有一个插入序列,位于84-104位(DGAHLPLLLPGGTVSAPLRLG)。同源比对发现鲤Orexin-B比Orexin-A更保守。Prepro-orexin基因组织分布发现,prepro-orexin基因在脑部尤其是下丘脑高表达,在外周组织中肝、肠、肌的Orexin表达量较高。2.食欲素A对鲤血糖的调节及其对葡萄糖转运载体、糖酵解糖异生相关基因表达的影响注射Orexin-A可显著降低由灌喂葡萄糖导致的高血糖水平。在实验1 h后,注射Orexin-A组显著低于未注射组(p<0.05),且与注射浓度负相关。灌喂葡萄糖后,肠的葡萄糖转运蛋白2(Glucose transporter 2 proteins,glut2)和钠葡萄糖共转运蛋白1(Na~+/glucose co-transporter 1 proteins,sglt1)基因表达量显著上调,但注射Orexin-A后2h,肠glut2和sglt1表达量显著低于未注射组(p<0.05);而肝的glut2和sglt1基因以及肌的葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporter 4 proteins,glut4)基因的表达量注射组显著高于未注射组(p<0.05)。灌喂葡萄糖后,肠葡萄糖转运活性也显著升高(p<0.05),但注射Orexin-A组显著低于未注射组(p<0.05)。3.Orexin-A对鲤原代肝细胞葡萄糖代谢的影响葡萄糖浓度对鲤肝细胞糖代谢的影响的研究结果表明,单独用葡萄糖(5 mM)处理对鲤肝细胞葡萄糖代谢相关基因表达没有影响,而15mM葡萄糖处理显著增加了glut2mRNA的表达,促进了糖酵解与糖异生关键基因表达。Orexin-A(100,1000 nM)可以刺激肝细胞中glut2 mRNA的表达(p<0.05),且呈剂量依赖性;Orexin-A(100,1000nM)可以显著提高肝细胞糖原合成酶(glycogen synthase,gys)基因的表达(p<0.05),同样呈剂量依赖性;Orexin-A(100,1000 nM)可以刺激肝细胞糖酵解关键酶己糖激酶(Hexokinase,hk)和葡萄糖激酶(Glucokinase,gk),抑制糖异生关键酶果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase,fbpase)的表达。4.Orexin-A对鲤下丘脑摄食相关神经肽表达的影响采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测糖耐量实验后下丘脑促进摄食的神经肽Y(Neuropeptide Y,npy)及抑制摄食的可卡因安非他明调节转录产物(Cocaine-amphetamine-regulated transcript,cart)和阿黑皮素(Proopiomelanocortin,pomc)在鲤中表达变化,结果显示灌喂葡萄糖后,npy基因表达量显著降低;pomc、cart基因表达量显著升高(与0h组相比)。注射Orexin-A后,注射组npy基因的表达量显著低于未注射组,cart mRNA表达量注射组显著高于未注射组,pomc mRNA表达量在1 h Orexin-A 1000 ng/g同样组显著高于未注射组。综上所述,在体实验的结果表明灌喂葡萄糖后注射Orexin-A能显著缓解高血糖现象,其降血糖能力可能是通过抑制肠葡萄糖的吸收,促进肝和肌葡萄糖利用来实现的;离体细胞实验也验证了Orexin-A能够促进肝对葡萄糖的吸收和利用。同时,在灌喂葡萄糖导致的糖负荷条件下Orexin-A能显著抑制促食肽npy的基因表达,促进抑食肽cart和pomc的基因表达。根据实验结果,推测Orexin-A可能是通过调控机体葡萄糖吸收、促进葡萄糖利用和抑制机体摄食来维持机体血糖稳态。