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本文探讨人G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)超家族成员缓激肽1型受体(bradykinin receptor1, B1R)和Apelin受体(putative receptor protein related to AT1, APJ)能否形成异源二聚体以及对细胞内信号途径和生理功能产生影响。为探明B1R和APJ参与生理功能的分子机制提供实验依据,为探寻相关疾病发生的分子机制提供理论依据。 我们利用分子克隆方法成功构建真核重组质粒:pRluc-hAPJ-pcDNA3.1和pEGFP-hB1R-pcDNA3.1,并用 Western blot和免疫荧光染色法验证其在人胚肾(human embryonic kidney293, HEK293)细胞上的表达。然后,用激光共聚焦检测和生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)研究B1R与APJ的异源二聚化。结合双荧光素酶报告基因检测细胞内三个关键信号转导分子的变化:血清反应元件(Serum response element, SRE)、钙调磷酸酶-活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)和cAMP反应元件(cAMP response element, CRE),来研究APJ/B1R异源二聚体信号转导方面的特点。对于功能方面,则利用Western blot和shRNA技术检测人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)中内皮型一氧化氮合酶( endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS)磷酸化水平的变化。结果显示:pRluc-hAPJ-pcDNA3.1和pEGFP-hB1R-pcDNA3.1重组质粒构建正确,并且受体均在细胞膜上表达,两种受体存在着相互作用的空间基础;BRET实验表明,APJ/B1R能发生组成型异源二聚化,经配体apelin-13或des-Arg9-BK单独刺激后,BRET信号明显增强,配体能诱导增强二者的相互作用强度;检测SRE、NFAT、CRE三种关键信号转导分子发现,共转APJ/B1R组较单转APJ、B1R组,CRE-1uc活性显著增强,NFAT-1uc的活性显著增强,而SRE-luc无显著变化。这说明,APJ/B1R体与Gαq的结合力增加,与Gαi的结合力减小,信号转导途径偏向PKC途径。在內源表达APJ和B1R的HUVECs中,配体apelin-13和des-Arg9-BK都能诱导eNOS的磷酸化增强。APJ表达水平下调后,eNOS的磷酸化水平下降,但在激动剂apelin-13和des-Arg9-BK的刺激下,eNOS磷酸化水平又上升。这可能由于APJ/B1R异源二聚体,在配体刺激下利于激活PKC信号通路,促进eNOS的磷酸化引起。 本研究发现在转染APJ/B1R的HEK293细胞中,B1R和APJ能够形成组成型异源二聚体,在apelin-13或des-Arg9-BK的刺激下,信号转导途径转向PKC途径,调控eNOS的磷酸化水平。为揭示APJ和B1R参与生理功能的胞内分子机制提供了新的理论基础和实验依据,为开发治疗心血管疾病的药物提供新的潜在作用靶点。