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研究背景:肝纤维化是指肝脏炎症或直接毒性损伤后所引起的以肝内细胞外基质(ECM)沉积过多为特征的一类慢性肝病。研究表明,肝纤维化是可以逆转的病变,但临床上至今缺乏确切有效的抗肝纤维化药物与方法。近几年研究发现我国的中草药具有良好的抗肝纤维化疗效。本研究根据国内外研究现状及我们的前期工作基础,将熊果酸作用于二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化实验大鼠,研究熊果酸对实验动物肝纤维化的治疗作用及作用机制,为肝纤维化治疗提供新的治疗方案。目的:通过动物实验观察熊果酸对肝纤维化大鼠肝功能、肝脏组织病理学的影响;并通过观察熊果酸抗氧化作用、对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)及其抑制因子-1(TIMP-1) mRNA表达以及对α-SMA蛋白表达的影响,探讨熊果酸抗肝纤维化的可能作用机理。方法:采用1%DMN溶液(1ml/kg)给予大鼠腹腔注射诱导肝纤维化模型,正常对照组给予生理盐水1ml/kg腹腔注射,每周连续3天,造模4周。造模结束后将大鼠随机分组并开始每天腹腔给药,正常对照组和模型组予以生理盐水1ml/kg/d;秋水仙碱组用量为0.1mg/kg/d;熊果酸高、中、低剂量组用量分别为10mg/kg/d、20mg/kg/d、40mg/kg/d。分别在药物治疗2周、4周采用全自动生化仪检测各组大鼠血清ALT、AST、ALB、A/G。药物治疗4周后肉眼观察各组大鼠肝脏大体表现;HE观察肝小叶结构、肝细胞坏死程度及纤维组织增生程度;VG染色观察胶原纤维增生程度,并用半定量标准判断胶原纤维增生程度;采用TBA法检测血清SOD、MDA的含量;RT-PCR方法检测MMP-1mRNA、TIMP-1mRNA的表达;Westernblot方法检测α-SMA蛋白的表达。结果: 1、DMN诱导的模型组与正常对照组相比大鼠血清肝功能指标ALT、AST的含量均明显升高,ALB、A/G含量下降(P<0.01);各剂量熊果酸和秋水仙碱作用肝纤维化大鼠2周、4周后,同时间点熊果酸各剂量组ALT、AST相比模型组明显降低,ALB、A/G则明显升高(P<0.05,P<0.01);秋水仙碱组对A/G无明显影响,余作用介于熊果酸低剂量组与熊果酸中剂量组之间且无时间依赖性。2、肉眼观察模型组大鼠肝脏增大,颜色浅,边缘钝,质地硬,表面有粗颗粒状表现,与周围器官粘连广泛;肉眼观察熊果酸各剂量组和秋水仙碱组肝脏有明显改善。HE染色模型组肝小叶结构紊乱、肝细胞坏死明显、间质细胞大量弥漫增生、纤维组织增生明显,形成肝纤维化;VG染色模型组汇管区见大量胶原纤维,胶原纤维构成的纤维间隔形成,肝窦内连续或断续性环状胶原沉积,肝脏组织胶原纤维增生程度与正常对照组比较明显升高(P<0.01)。HE染色熊果酸各剂量组和秋水仙碱组各组肝组织肝小叶结构改善,肝细胞坏死和纤维组织增生明显减轻;VG染色熊果酸各剂量组和秋水仙碱组胶原纤维增生明显减轻,熊果酸中、高剂量组与模型组、秋水仙碱组比较肝脏组织胶原纤维增生程度明显下降(P<0.05,P<0.01)。3、模型组SOD表达值为(124.73±19.79)U?ml-1,较正常对照组SOD (176.79±26.69) U?ml-1明显降低(P<0.01);而模型组MDA表达值(66.44±6.51) nmol?ml-1,较正常对照组MDA (7.95±0.97) nmol?ml-1明显升高(P<0.01);熊果酸高、中、低剂量组和秋水仙碱组SOD表达值分别为(154.29±15.39)U?ml-1、(201.22±3.38)U?ml-1、(245.74±37.24) U?ml-1、(128.45±10.06)U?ml-1,熊果酸各剂量组均比模型组显著升高(P<0.01),秋水仙碱组与模型组相比差异无统计学意义;MDA表达值分别为(26.69±4.75)nmol?ml-1、(14.38±0.48)nmol?ml-1、(10.50±1.44) nmol?ml-1、(42.02±6.29)nmol?ml-1,相比模型组显著降低(P<0.05, P<0.01),熊果酸各剂量组与秋水仙碱组之间MDA差异有统计学意义(P<0.01)。4、模型组MMP-1 mRNA的表达较正常对照组明显降低(P<0.01),而模型组TIMP-1mRNA的表达较正常对照组明显升高(P<0.01);熊果酸各剂量组和秋水仙碱组MMP-1 mRNA的表达较模型组升高(P<0.01),而TIMP-1mRNA表达较模型组降低(P<0.05,P<0.01);熊果酸中、高剂量组相比秋水仙碱组MMP-1 mRNA的表达显著升高(P<0.01) ,而熊果酸各剂量组相比秋水仙碱组TIMP-1mRNA的表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。5、模型组α-SMA蛋白的表达较正常对照组明显升高(P<0.01);熊果酸各剂量组α-SMA蛋白的表达较模型组明显降低(P<0.01);秋水仙碱组与模型组差异无统计学意义,熊果酸各剂量组相比秋水仙碱组α-SMA蛋白的表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论:①熊果酸具有改善肝纤维化作用,表现在熊果酸可降低ALT、AST,升高ALB、A/G,从而明显改善肝纤维化大鼠肝功能;HE染色示熊果酸可改善肝小叶结构,明显减轻肝细胞坏死和纤维组织增生,VG染色示熊果酸可明显减少胶原纤维的沉积,降低肝脏组织胶原纤维增生程度;熊果酸的综合作用明显强于秋水仙碱且本实验熊果酸剂量以40mg/kg/d作用最为显著,优于熊果酸10mg/kg/d、20mg/kg/d剂量组。②熊果酸抗肝纤维化的可能作用机制表现在:1)通过增加SOD的表达、降低MDA表达来阻断氧化应激过程、抑制脂质过氧化;2)通过上调MMP-1mRNA表达、下调TIMP-1mRNA表达从而可能增加ECM的降解,减少ECM的沉积;3)通过下调α-SMA蛋白表达抑制HSC活化而减少致肝纤维化因子的产生。