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背景:大量研究表明,神经管畸形(NTDs)20%由遗传因素造成,80%由非遗传因素造成,但详细机制尚未完全清楚。叶酸缺乏是导致NTDs发生重要病因之一,是近年来NTDs研究的最重要成果。大约50-70%的NTDs可通过适当补充叶酸有效预防,因此,以叶酸为切入点,研究NTDs的具体发病机制对NTDs的防治有着重要的意义。值得注意的是,迄今为止,未见通过单纯饮食控制成功建立叶酸缺乏诱导的NTDs动物模型的报道,我们前期根据叶酸缺乏是通过叶酸不同代谢途径的代谢障碍间接导致NTDs及其他发育障碍的假设,阻断叶酸相应的叶酸代谢通路,成功制备了二氢叶酸还原酶、核苷酸还原酶、胸苷酸合成酶、甲基转移酶相关代谢途径障碍NTDs小鼠系列动物模型,并证实以上关键酶所涉及的相关代谢通路障碍均可独立引起NTDs的发生。为深入探索叶酸缺乏导致NTDs及出生发育障碍提供了模型基础,通过不同模型的比较,可进一步证实叶酸不同代谢途径引起NTDs及出生缺陷的代谢机理。本文涉及的甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶(GARFT)也是叶酸实现其生物效应的相关代谢通路关键酶之一,抑制其活性造成相关代谢障碍,是否可以诱发NTDs及其初步的分子机制是本文拟解决的科学问题。本科学问题的证实不仅对阐明叶酸的不同代谢途径与NTDs及发育障碍的关系有着重要的意义,同时为在单纯嘌呤单核苷酸代谢障碍的条件下进一步研究NTDs及发育障碍的机制提供了重要模型基础。该方面的研究尚未见报道。目的:1、采用甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶(Glycinamide ribonucleotide formyl transferase,GARFT)特异性抑制剂洛美曲松(Lometrexol,dideazatetrahydrofolic acid,DDATHF)对怀孕小鼠进行干预,诱导出嘌呤代谢异常的小鼠NTDs。2、观察DDATHF诱导的小鼠NTDs胚胎组织GARFT酶活性及嘌呤代谢的情况。3、研究DDATHF干扰嘌呤从头代谢对小鼠NTDs胚胎组织细胞增殖和凋亡的作用。4、研究DDATHF诱导的GAR-FGAR代谢障碍小鼠胚胎干细胞增殖和凋亡的作用。方法:将19-21g C57BL/6J孕鼠随机分组,实验组于孕7.5(E7.5)天腹腔DDATHF给药,生理盐水为对照组。孕11.5(E11.5)天,取出胚胎,镜下观察胚胎神经管及畸形的形态特征;利用组胚病理学方法进一步观察胚胎组织结构畸变情况;用GARFT酶活性测定试剂盒和高效液相色谱法在不同时间点(0h,6h,24h,48h,96h)测定胚胎组织的GARFT活性及ATP、GTP、d ATP和d GTP的含量;通过免疫组化、实时荧光定量PCR及Western-Blot的方法,分析DDATHF制备的NTDs凋亡及增殖的状况。CCK-8,流式细胞法及慧星实验进一步分析DDATHF对小鼠D3胚胎干细胞增殖和凋亡的作用。结果:1、DDATHF成功诱导出小鼠NTDs,最佳剂量为45 mg/kg,NTDs发生率为31.7%,小鼠NTDs主要表现后脑神经管未闭,其它畸形主要为颅面畸形和发育迟缓,HE染色可见神经管畸形胎鼠后脑泡未闭合。2、GARFT活性检测发现E7.5腹腔注射DDATHF后,胚胎组织中DDATHF活性约在6小时降到最低,在注射DDATHF96小时后,GARFT活性仍然低于正常水平。3、HPLC结果显示,DDATHF诱导的NTDs胚胎组织中ATP、GTP、d ATP和d GTP的含量在腹腔注射DDATHF后均逐渐降低,在注射DDATHF 96小时后其含量仍低于正常水平。4、采用免疫组化方法检测Phospho-Histone H3(PH3)和Caspase-3(Casp-3)在胎鼠神经管神经上皮细胞的表达情况情况,PH3在NTDs组胚胎组织细胞的表达明显低于对照组,Casp-3在NTDs组阳性细胞数量明显多与对照组(P<0.05)。5、Western-Blot检测小鼠胚胎组织中PH3蛋白和Casp-3蛋白的表达水平,PH3蛋白含量明显低于对照组,Casp-3蛋白在NTDs组表达量明显升高(P<0.05)。6、采用RT-PCR的方法检测小鼠胚胎组织中Pcna,Foxg1,Ptch1,Apaf1,Casp-3和Casp-9的表达量,NTDs胚胎组织中Pcna,Foxg1和Ptch1的表达量显著低于正常组,Apaf1,Casp-3和Casp-9的表达量在NTDs组明显升高(P<0.05)。7、CCK-8、Brdu流式细胞术检测DDATHF抑制D3鼠胚胎干细胞(ESC)细胞增殖(P<0.05)。8、Annexin V/PI双染法、线粒体膜电位法及慧星电泳实验检测DDATHF诱导ESC细胞凋亡(P<0.05)。结论:1、成功建立DDATHF致C57BL/6J小鼠胚胎NTDs动物模型。2、研究表明了嘌呤代谢异常与NTDs相关,为叶酸缺乏引起NTDs的机制研究作了重要补充。3、DDATHF可引起胚胎组织细胞的增殖减少和凋亡增加,神经管发育过程中的平衡紊乱,可能是DDATHF导致NTDs发生的机制之一。4、DDATHF诱导的GAR-FGAR代谢障碍D3鼠胚胎干细胞(ESC)增殖抑制,凋亡增加。