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【目的】
1.明确分泌载体膜蛋白2（secretorycarriermembraneprotein2，SCAMP2）参与载脂蛋白A-1（apolipoproteinA-1，apoA-1）介导的胆固醇流出过程，并探讨其作用的可能机制。
2.以SCAMP2基因敲除（SCAMP2-/-）小鼠为研究对象，研究SCAMP2对小鼠脂质代谢的影响。
【方法】
1.用160nmol/L佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）处理人单核THP-1细胞48h，诱导悬浮细胞分化为贴壁巨噬细胞，用50μg/ml乙酰化的LDL（acetylatedLDL，Ac-LDL）作用48h，建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型。加入10μg/mlapoA-1作用12h后，收集细胞，提取RNA，qRT-PCR分析SCAMP1～SCAMP5亚型mRNA的表达变化。液体闪烁计数法检测胆固醇流出的改变；Westernblot分析脂肪分化相关蛋白（adiposedifferentiation-relatedprotein，ADFP）、腺苷三磷酸结合盒转运子A1（ATPbindingcassettetransporterA1，ABCA1）和SCAMP2蛋白的表达变化。
2.SCAMP2shRNA干扰慢病毒作用泡沫细胞，qRT-PCR和Westernblot分析SCAMP2基因干扰效率；液体闪烁计数法检测泡沫细胞、apoA-1处理泡沫细胞、SCAMP2干扰泡沫细胞的胆固醇流出率；qRT-PCR分析不同处理组细胞ABCA1mRNA的表达；Westernblot分析ADFP和ABCA1蛋白的表达；激光共聚焦显微镜观察不同组细胞内ADFP及ABCA1的表达。
3.Jackson实验室所引进C57BL/6NJ-Scamp2em1(IMPC)J/J小鼠繁殖成功后，提取鼠耳组织DNA，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型，并通过Westernblot鉴定SCAMP2蛋白的表达。
4.8周龄雄性SCAMP2-/-小鼠处死后，取腹腔巨噬细胞，用50μg/mlAc-LDL处理建立泡沫细胞模型，液体闪烁计数法检测泡沫细胞及10μg/mlapoA-1处理组泡沫细胞的胆固醇流出率，并计算净胆固醇流出率；Westernblot检测不同组泡沫细胞ADFP及ABCA1的表达。
5.SCAMP2-/-小鼠腹腔巨噬细胞分别用50μg/mlAc-LDL和0.1mg/ml油酸作用后，油红O染色及BODIPY493/503染色，观察小鼠泡沫细胞脂质蓄积情况。
6.繁殖获得足够数量6～8周龄雄性小鼠，基因鉴定后分为四组：SCAMP2+/+普通饲料组、SCAMP2+/+高脂饲料组、SCAMP2-/-普通饲料组、SCAMP2-/-高脂组，每组12只，9周后颈椎脱臼法处死动物，取肝脏称重拍照。取部分肝脏利用商品化试剂盒对组织甘油三酯（Triglyceride，TG）和总胆固醇（Totalcholesterol，TC）进行测定；液氮研磨获肝脏蛋白，Westernblot分析ADFP、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzymeAreductase，HMGCR）和乙酰辅酶A羧化酶（AcetylCoAcarboxylase，ACC）的表达。
7.经9周饲料喂养后处死小鼠，放置在解剖手术台，心脏分别灌注预冷PBS和4%多聚甲醛，轻轻剥离掉动脉周围附着的筋膜组织，取小鼠全长动脉后，用多聚甲醛固定24h，5%油红O染料进行全长动脉染色。
【结果】
1.qRT-PCR分析显示，apoA-1处理组SCAMP2mRNA表达量比对照组Ac-LDL组升高了75%（P<0.01），apoA-1处理组其它SCAMP亚型mRNA相对表达量与Ac-LDL相比，没有统计学差异（P>0.05）。液体闪烁计数法测胆固醇流出率结果显示，apoA-1组的胆固醇流出率是Ac-LDL组的2.1倍（P<0.01）；Westernblot分析显示，apoA-1处理的泡沫细胞组与对照Ac-LDL组相比，ADFP表达下调50%，ABCA1蛋白表达量上调50%，SCAMP2表达上调39%，结果均具有统计学意义（P<0.05）。
2.通过慢病毒干扰，与对照组相比，SCAMP2干扰组SCAMP2mRNA表达量下降82%（P<0.01），SCAMP2蛋白表达下降69%（P＜0.01）。SCAMP2干扰组的泡沫细胞胆固醇流出率与对照组相比降低了24%（P＜0.05），SCAMP2干扰组ADFP蛋白是对照组的1.3倍（P<0.05）；激光共聚焦显微镜结果显示，Ac-LDL组泡沫细胞内有大量ADFP红色荧光表达，apoA-1处理的泡沫细胞和NC组泡沫细胞内ADFP荧光明显减弱，而SCAMP2干扰的泡沫细胞内ADFP荧光明显增强。
3.与对照组相比，SCAMP2干扰组ABCA1mRNA水平下降46%（P<0.05），ABCA1蛋白表达下降35%（P<0.05）；ABCA1的红色荧光在THP-1巨噬细胞内表达较弱，Ac-LDL作用的泡沫细胞内ABCA1表达增强，apoA-1处理的泡沫细胞和NC泡沫细胞内红色荧光更强，而SCAMP2干扰的泡沫细胞内ABCA1表达下降。
4.实验结果表明，SCAMP2-/-小鼠腹腔巨噬泡沫细胞的胆固醇流出率与对照SCAMP2+/+小鼠相比降低20%（P<0.05），提示SCAMP2基因敲除小鼠泡沫细胞内脂质蓄积。加入apoA-1处理后，SCAMP2-/-小鼠泡沫细胞的净胆固醇流出率比对照SCAMP2+/+小鼠低48%（P<0.05），说明SCAMP2参与了apoA-1介导的胆固醇流出过程。与SCAMP2+/+小鼠相比，SCAMP2-/-小鼠泡沫细胞内ADFP表达高48%（P<0.05），经apoA-1作用后，SCAMP2-/-小鼠泡沫细胞内ADFP比对照组高55%（P<0.05）。
5.油红O染色及BODIPY493/503染色显示，与SCAMP2+/+小鼠腹腔泡沫细胞相比，SCAMP2-/-小鼠腹腔泡沫细胞内的脂滴增多且变大，经apoA-1处理后，两组泡沫细胞富脂均减少，但SCAMP2-/-小鼠腹腔泡沫细胞内脂质下降程度较弱。
6.SCAMP2-/-高脂小鼠与SCAMP2+/+高脂小鼠相比，肝脏重量明显增加，肝脏TG水平上调了27%（P<0.05），TC水平升高了62%（P<0.01）；肝脏蛋白ADFP、HMGCR、ACC在SCAMP2基因敲除高脂小鼠组表达量最高（P<0.05）。
7.经9周饲料喂养，处死不同组小鼠，剥离全长动脉，油红O染色观察，SCAMP2-/-高脂小鼠与SCAMP2+/+高脂小鼠未发现动脉斑块形成。
【结论】
SCAMP2参与apoA-1介导的胆固醇流出过程，干扰SCAMP2基因，泡沫细胞内胆固醇流出降低，胞内脂质蓄积。SCAMP2-/-高脂小鼠肝脏代谢异常，脂质代谢相关基因表达发生改变。
1.明确分泌载体膜蛋白2（secretorycarriermembraneprotein2，SCAMP2）参与载脂蛋白A-1（apolipoproteinA-1，apoA-1）介导的胆固醇流出过程，并探讨其作用的可能机制。
2.以SCAMP2基因敲除（SCAMP2-/-）小鼠为研究对象，研究SCAMP2对小鼠脂质代谢的影响。
【方法】
1.用160nmol/L佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）处理人单核THP-1细胞48h，诱导悬浮细胞分化为贴壁巨噬细胞，用50μg/ml乙酰化的LDL（acetylatedLDL，Ac-LDL）作用48h，建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型。加入10μg/mlapoA-1作用12h后，收集细胞，提取RNA，qRT-PCR分析SCAMP1～SCAMP5亚型mRNA的表达变化。液体闪烁计数法检测胆固醇流出的改变；Westernblot分析脂肪分化相关蛋白（adiposedifferentiation-relatedprotein，ADFP）、腺苷三磷酸结合盒转运子A1（ATPbindingcassettetransporterA1，ABCA1）和SCAMP2蛋白的表达变化。
2.SCAMP2shRNA干扰慢病毒作用泡沫细胞，qRT-PCR和Westernblot分析SCAMP2基因干扰效率；液体闪烁计数法检测泡沫细胞、apoA-1处理泡沫细胞、SCAMP2干扰泡沫细胞的胆固醇流出率；qRT-PCR分析不同处理组细胞ABCA1mRNA的表达；Westernblot分析ADFP和ABCA1蛋白的表达；激光共聚焦显微镜观察不同组细胞内ADFP及ABCA1的表达。
3.Jackson实验室所引进C57BL/6NJ-Scamp2em1(IMPC)J/J小鼠繁殖成功后，提取鼠耳组织DNA，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型，并通过Westernblot鉴定SCAMP2蛋白的表达。
4.8周龄雄性SCAMP2-/-小鼠处死后，取腹腔巨噬细胞，用50μg/mlAc-LDL处理建立泡沫细胞模型，液体闪烁计数法检测泡沫细胞及10μg/mlapoA-1处理组泡沫细胞的胆固醇流出率，并计算净胆固醇流出率；Westernblot检测不同组泡沫细胞ADFP及ABCA1的表达。
5.SCAMP2-/-小鼠腹腔巨噬细胞分别用50μg/mlAc-LDL和0.1mg/ml油酸作用后，油红O染色及BODIPY493/503染色，观察小鼠泡沫细胞脂质蓄积情况。
6.繁殖获得足够数量6～8周龄雄性小鼠，基因鉴定后分为四组：SCAMP2+/+普通饲料组、SCAMP2+/+高脂饲料组、SCAMP2-/-普通饲料组、SCAMP2-/-高脂组，每组12只，9周后颈椎脱臼法处死动物，取肝脏称重拍照。取部分肝脏利用商品化试剂盒对组织甘油三酯（Triglyceride，TG）和总胆固醇（Totalcholesterol，TC）进行测定；液氮研磨获肝脏蛋白，Westernblot分析ADFP、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzymeAreductase，HMGCR）和乙酰辅酶A羧化酶（AcetylCoAcarboxylase，ACC）的表达。
7.经9周饲料喂养后处死小鼠，放置在解剖手术台，心脏分别灌注预冷PBS和4%多聚甲醛，轻轻剥离掉动脉周围附着的筋膜组织，取小鼠全长动脉后，用多聚甲醛固定24h，5%油红O染料进行全长动脉染色。
【结果】
1.qRT-PCR分析显示，apoA-1处理组SCAMP2mRNA表达量比对照组Ac-LDL组升高了75%（P<0.01），apoA-1处理组其它SCAMP亚型mRNA相对表达量与Ac-LDL相比，没有统计学差异（P>0.05）。液体闪烁计数法测胆固醇流出率结果显示，apoA-1组的胆固醇流出率是Ac-LDL组的2.1倍（P<0.01）；Westernblot分析显示，apoA-1处理的泡沫细胞组与对照Ac-LDL组相比，ADFP表达下调50%，ABCA1蛋白表达量上调50%，SCAMP2表达上调39%，结果均具有统计学意义（P<0.05）。
2.通过慢病毒干扰，与对照组相比，SCAMP2干扰组SCAMP2mRNA表达量下降82%（P<0.01），SCAMP2蛋白表达下降69%（P＜0.01）。SCAMP2干扰组的泡沫细胞胆固醇流出率与对照组相比降低了24%（P＜0.05），SCAMP2干扰组ADFP蛋白是对照组的1.3倍（P<0.05）；激光共聚焦显微镜结果显示，Ac-LDL组泡沫细胞内有大量ADFP红色荧光表达，apoA-1处理的泡沫细胞和NC组泡沫细胞内ADFP荧光明显减弱，而SCAMP2干扰的泡沫细胞内ADFP荧光明显增强。
3.与对照组相比，SCAMP2干扰组ABCA1mRNA水平下降46%（P<0.05），ABCA1蛋白表达下降35%（P<0.05）；ABCA1的红色荧光在THP-1巨噬细胞内表达较弱，Ac-LDL作用的泡沫细胞内ABCA1表达增强，apoA-1处理的泡沫细胞和NC泡沫细胞内红色荧光更强，而SCAMP2干扰的泡沫细胞内ABCA1表达下降。
4.实验结果表明，SCAMP2-/-小鼠腹腔巨噬泡沫细胞的胆固醇流出率与对照SCAMP2+/+小鼠相比降低20%（P<0.05），提示SCAMP2基因敲除小鼠泡沫细胞内脂质蓄积。加入apoA-1处理后，SCAMP2-/-小鼠泡沫细胞的净胆固醇流出率比对照SCAMP2+/+小鼠低48%（P<0.05），说明SCAMP2参与了apoA-1介导的胆固醇流出过程。与SCAMP2+/+小鼠相比，SCAMP2-/-小鼠泡沫细胞内ADFP表达高48%（P<0.05），经apoA-1作用后，SCAMP2-/-小鼠泡沫细胞内ADFP比对照组高55%（P<0.05）。
5.油红O染色及BODIPY493/503染色显示，与SCAMP2+/+小鼠腹腔泡沫细胞相比，SCAMP2-/-小鼠腹腔泡沫细胞内的脂滴增多且变大，经apoA-1处理后，两组泡沫细胞富脂均减少，但SCAMP2-/-小鼠腹腔泡沫细胞内脂质下降程度较弱。
6.SCAMP2-/-高脂小鼠与SCAMP2+/+高脂小鼠相比，肝脏重量明显增加，肝脏TG水平上调了27%（P<0.05），TC水平升高了62%（P<0.01）；肝脏蛋白ADFP、HMGCR、ACC在SCAMP2基因敲除高脂小鼠组表达量最高（P<0.05）。
7.经9周饲料喂养，处死不同组小鼠，剥离全长动脉，油红O染色观察，SCAMP2-/-高脂小鼠与SCAMP2+/+高脂小鼠未发现动脉斑块形成。
【结论】
SCAMP2参与apoA-1介导的胆固醇流出过程，干扰SCAMP2基因，泡沫细胞内胆固醇流出降低，胞内脂质蓄积。SCAMP2-/-高脂小鼠肝脏代谢异常，脂质代谢相关基因表达发生改变。