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研究背景:支气管哮喘(简称哮喘)是由嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞、肥大细胞等炎症细胞和气道上皮细胞、气道平滑肌细胞等气道结构细胞共同参与的慢性气道炎症性疾病。支气管哮喘的三个主要病理特征分别为气道慢性炎症、气道平滑肌功能紊乱和气道重塑。气道重塑是指发生在大小气道的结构改变,包括上皮化生、杯状细胞增生及黏液分泌增加、上皮下纤维化、平滑肌层增厚、新生血管生成等。这些重塑的病理特征引起气道高反应性,气道水肿和黏液高分泌、气道壁增厚、气道狭窄等,导致不良临床转归。上皮和底层的间充质之间的相互作用被称为上皮间充质营养单位(the epithelia-mesenchymal trophic unit,EMTU),可驱动哮喘气道重塑的病理生理过程。上皮细胞受到病毒、细菌等微生物以及各种内源性、外源性变应原等因素损伤后,释放多种细胞因子如胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)、白介素 25(interleukin-25,IL-25)和白介素33(interleukin-33,IL-33)等,激活细胞间信号转导通路,促进成纤维细胞的激活。间质固有成纤维细胞在这些细胞因子或者炎症介质如生长因子β(growth factor beta,TGFβ)或者IL-33刺激下激活分化成为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞,由间质固有成纤维细胞活化而成,其细胞超微结构与生理功能介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间,具有很强的分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白和收缩功能。肌成纤维细胞是ECM蛋白质(包括腱生蛋白,双糖链蛋白,纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ,Ⅲ,Ⅴ等)的主要来源,导致基底膜增厚以及气道上皮下纤维化,最终导致气道重塑。IL-33是第1 1个IL-1超家族成员,由多种细胞遭受促炎刺激后裂解所释放。研究表明IL-33可直接促进哮喘重塑。IL-33 通过与 ST2 和 IL-1 受体辅助蛋白(IL-1 receptor accessory protein,IL-1 Rap)结合,募集髓系分化反应蛋白 88(the myeloid differentiation primary-response protein 88,MYD88)复合物,通过未知机制激活下游信号通路:鞘氨醇激酶(the sphingosine kinases,SPHK)通路和有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路。MAPK 通路包括 c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNKs)、p38 MAPK和细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)。ERK1/2 介导体内多条信号途径,参与了多种哮喘发病机制,在哮喘气道炎症与气道重塑中具有重要作用。有研究结果显示,在基因水平和蛋白水平抑制ERK1/2的作用均可阻断IL-13诱导的气道重塑。MAPKs介导IL-33诱导的嗜酸性粒细胞趋化因子的表达。IL-33可通过ST2/ERK1/2/MSK1信号通路导致IL-17分泌增加进而导致哮喘气道炎症加重。因此,IL-33可能通过ST2/ERK1/2/MSK1信号通路参与诱导哮喘气道重塑。目的:为探讨IL-33诱导哮喘气道重塑的具体分子生物学机制,本研究通过复制小鼠哮喘模型以及体外培养HLF-1肺成纤维细胞,研究IL-33通过其受体ST2对ERK1/2及其下游丝裂原和应激激活蛋白激酶1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1,MSK1)的磷酸化以及下游分子α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)与 1 型胶原蛋白(type 1 collagen,Coll)的表达的影响,探讨IL-33在哮喘气道重塑中的可能作用机制。方法:首先,检测哮喘患者肺组织中IL-33及其受体ST2的表达水平。培养人成纤维细胞HLF-1,分别给予人重组IL-33(rIL-33)、ST2的抗体联合rIL-33、ERK1/2的抑制剂U0126联合rIL-33、MSK1的抑制剂H89联合rIL-33处理并设立相应对照组,Western blot法及细胞免疫荧光技术观察ERK1/2及MSK1的磷酸化,Western blot法及实时荧光定量PCR检测α-SMA与Coll的mRNA和蛋白表达水平。雄性BALB/c小鼠随机分为对照组、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)处理组和可溶性ST2(sST2)联合OVA处理组。HE染色观察小鼠气道重塑特征,免疫组织化学染色及Western blot法观察IL-33及其受体ST2、气道重塑标志物α-SMA和Coll的表达,以及ERK1/2及MSK1的磷酸化水平。结果:1.哮喘患者气道上皮IL-33和ST2表达上调我们研究了哮喘患者和对照组气道组织中IL-33与ST2的表达。免疫组化染色显示哮喘患者气道上皮IL-33和ST2的免疫反应与对照组相比更明显。2.rIL-33上调人肺成纤维细胞(HLF-1)中ST2、α-SMA和Coll的表达以及ERK1/2和MSK1的磷酸化rIL-33可上调入肺成纤维细胞中ST2、α-SMA和Coll的蛋白表达水平,并呈浓度依赖性和时间依赖性,分别在50 ng/ml以及24h达到最高水平。ST2最近被研究确定为IL-33受体。Western Blot检测显示ST2蛋白表达水平显著升高。Western Blot检测显示,与对照组相比,rIL-33刺激可显著上调HLF-1中ERK1/2和MSK1的磷酸化水平。3.ST2参与rIL-33诱导的HLF-1中α-SMA和Coll的表达增加以及ERK1/2和MSK1的磷酸化水平升高Western Blot检测以及细胞免疫荧光结果显示,与对照组相比,ST2抗体预处理组ERK1/2和MSK1的磷酸化水平显著降低。同样,Western Blot检测以及实时定量PCR结果显示,与对照组相比,ST2抗体预处理可显著降低α-SMA和Coll的表达水平。4.ERK1/2/MSK1 参与rIL-33诱导的HLF-1 中α-SMA和Coll的表达增加Western Blot检测以及细胞免疫荧光结果显示,与对照组相比,ERK1/2抑制剂U0126可显著降低ERK1/2和MSK1的磷酸化水平。MSK1抑制剂H89可显著降低MSK1的磷酸化水平并不能影响ERK1/2的磷酸化。说明MSK1是ERK1/2的下游信号分子。Western Blot检测以及实时定量PCR结果显示,与对照组相比,U0126及H89预处理均可显著降低α-SMA和Coll的表达水平。说明ERK1/2/MSK1参与rIL-33诱导的HLF-1中α-SMA和Coll的表达增加。5.小鼠哮喘模型肺组织病理学改变与对照组相比,HE染色显示OVA组小鼠气道上皮断裂、脱落,气道黏膜下炎性细胞浸润、胶原沉积,腔内炎性细胞渗出,基底膜增厚,平滑肌增生肥大,支气管壁明显增厚和管腔狭窄等。而sST2预处理组小鼠气道重塑特征不明显。6.sST2可降低哮喘模型小鼠肺组织中α-SMA与Coll的表达以及ERK1/2及MSK1的磷酸化与对照组相比,IL-33与气道重塑标志物α-SMA与Coll以及磷酸化的ERK1/2及MSK1在OVA组小鼠气道的表达明显增加,而在sST2预处理组α-SMA、Coll以及磷酸化的ERK1/2及MSK1的表达较OVA组明显降低。Western blot法检测结果与上述免疫组织化学染色结果一致。结论:IL-33可通过ST2/ERK1/2/MSK1信号通路诱导人肺成纤维细胞中α-SMA与Coll的mRNA表达。sST2可抑制哮喘小鼠肺组织中ERK1/2及MSK1的磷酸化以及α-SMA与Coll的表达。因此,阻断IL-33/ST2/ERK1/2/MSK1信号通路可为哮喘的治疗提供新的靶点。